喻 晶 張 宜 刁 波

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科 武漢 430070）

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中波紫外線輻照對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)通路和IL-6、IL-8表達(dá)的影響

喻 晶 張 宜 刁 波

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科 武漢 430070）

摘要為探究JAK-STAT信號(hào)通路與炎癥因子白細(xì)胞介素6、8(interleukn6、8，IL-6、IL-8)是否參與中波紫外線誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的輻射損傷，使用不同劑量中波紫外線(10、20、40 J/m2)照射血管內(nèi)皮細(xì)胞，照射后24 h通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的表達(dá)水平；Western-blot檢測(cè)JAK1、JAK2、STAT1、STAT3和p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(0 J/m2)相比，細(xì)胞經(jīng)不同劑量紫外線(10、20、40 J/m2)照射24 h后，IL-6 mRNA和IL-8 mRNA表達(dá)水平均升高，且與受照劑量呈劑量依賴性；JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)均升高，且上調(diào)程度與受照劑量呈劑量依賴性；JAK2和STAT3蛋白表達(dá)變化不明顯。結(jié)果提示，JAK-STAT信號(hào)通路及炎癥因子IL-6、IL-8參與中波紫外線照射HUVECs細(xì)胞損傷的調(diào)控。

關(guān)鍵詞中波紫外線，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，JAK-STAT信號(hào)通路，IL-6，IL-8

第一作者：喻晶，女，1986年8月出生，2012年于湖北中醫(yī)藥大學(xué)獲得碩士學(xué)位，現(xiàn)就職于廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院

First author: YU Jing (female) was born in August 1986, and received her master degree from Hubei University of Chinese Medicine in 2012. Now she works in Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command

Received 3 December 2015; accepted 24 January 2016

CLC TL7

隨著工業(yè)生產(chǎn)的不斷擴(kuò)大，排放的含氮?dú)怏w和氟利昂等廢氣造成大氣中臭氧層的破壞，以致到達(dá)地面的紫外強(qiáng)度日益增加。高強(qiáng)度的紫外照射可以對(duì)人體皮膚產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，引起皮膚紅腫、老化，產(chǎn)生水泡，甚至導(dǎo)致惡性皮膚癌。構(gòu)成皮膚血管壁的血管內(nèi)皮細(xì)胞是輻射相對(duì)敏感的細(xì)胞，其具有維護(hù)血管壁結(jié)構(gòu)完整和介導(dǎo)炎癥等功能，在輻射損傷發(fā)生、發(fā)展及愈合過程中起著重要作用，其功能和結(jié)構(gòu)的改變是照射后組織損傷反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinasessignal transducers and activators of transcription, JAK-STAT)信號(hào)通路可被諸多細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素家族[1]）及細(xì)胞生長(zhǎng)因子[2]（如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維生長(zhǎng)因子）誘導(dǎo)激活，在細(xì)胞的增殖、分化或凋亡、免疫功能調(diào)節(jié)、造血細(xì)胞生成、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著特異且多效性的生物學(xué)功能[3-5]。炎癥因子白細(xì)胞介素6、8(Interleukn6、8，IL-6、IL-8）和JAK-STAT信號(hào)通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞輻照損傷中的調(diào)控作用未見報(bào)道。本研究模擬紫外輻照HUVECs (Human umbilical vein endothelial cells)細(xì)胞損傷，觀察輻照后細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8和JAK-STAT信號(hào)通路的變化情況，探討血管內(nèi)皮細(xì)胞輻照損傷的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自NQBB公司；胰蛋白酶購(gòu)自Amersco公司；ReverTra Ace qPCR RT kit購(gòu)自TOYOBO公司；SYBR Green realtime PCR master mix plus購(gòu)自Takara公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠抗人多克隆抗體購(gòu)自杭州賢至生物有限公司；IL-6、IL-8及β-actin引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3抗體購(gòu)自abcam公司；辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記羊抗兔抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol試劑購(gòu)自Gibicol公司；其他試劑購(gòu)于國(guó)藥試劑，均為分析純。

1.1.2 儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7900，美國(guó)ABI）；熒光化學(xué)成像系統(tǒng)（Tanon-5200，上海天能科技有限公司）；紫外分光光度計(jì)（QPTIZEN 2120 UV，韓國(guó)）；超純水系統(tǒng)（Milipore FOMN23167H，美國(guó)密理博公司）；紫外線強(qiáng)度測(cè)量?jī)x（TLC-340，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；電泳儀（DYCZ-40，北京六一儀器廠）；垂直電泳槽（DYCZ-24DN，北京六一儀器廠）；水平搖床（TS-1，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs細(xì)胞由本院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科保存。細(xì)胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，以1.0×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37oC、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 照射條件

采用UVB紫外燈管照射，紫外線強(qiáng)度測(cè)量?jī)x監(jiān)測(cè)紫外強(qiáng)度為33.5 μW/cm2，受照劑量分別為10、20、40 J/m2。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分4組，設(shè)對(duì)照組，照射組（細(xì)胞受照劑量分別為10、20、40 J/m2）。各組細(xì)胞經(jīng)紫外線照射24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入1 mL的Trizol試劑，按Trizol說明書提取總RNA；cDNA合成，參照ReverTra Ace qPCR RT kit說明書進(jìn)行合成，引物序列見表1。

表1　IL-6、IL-8和β-actin引物的序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Table 1　Sequence and amplified fragment length of IL-6, IL-8 and β-actin

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件42oC 60 min，94oC 4 min，1個(gè)循環(huán)；PCR條件94oC 30 s，退火30 s，72oC 25 s，30個(gè)循環(huán)。IL-6、IL-8及β-actin退火溫度分別為60、60、6oC。

以達(dá)到指數(shù)增加時(shí)的循環(huán)周期數(shù)(Ct)作為計(jì)算依據(jù)：mRNA的相對(duì)表達(dá)E=2?ΔΔCt，ΔCt=Ct-測(cè)定

1.2.1 Western-blot檢測(cè)

將各組細(xì)胞分別經(jīng)0、10、20、40 J/m2劑量輻照，24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，裂解液裂解細(xì)胞，以12000 r/min離心15 min。收集細(xì)胞裂解物，蛋白濃度用BCA法進(jìn)行測(cè)定。取40 μg總蛋白在十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)緩沖液中煮7 min，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉90 min，然后依次滴加(1:500～1:1000)JAK1、JAK2、p-JAK1、p-JAK2、STAT1、STAT3、p-STAT1、p-STAT3和GAPDH抗體，4 oC過夜后TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。然后用1:5000的HRP-羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(Enhanced chemiluminescent, ECL)進(jìn)行曝光顯影，熒光化學(xué)成像系統(tǒng)進(jìn)行照相并用其附帶的軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 中波紫外線輻照誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞IL-6 mRNA及IL-8 mRNA水平的表達(dá)

內(nèi)參β-actin和目的基因IL-6、IL-8的溶解曲線均為單一峰，擴(kuò)增曲線重合正常，說明引物設(shè)計(jì)正確，無引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增（圖1）。

HUVECs細(xì)胞經(jīng)10、20、40 J/m2紫外照射后，與對(duì)照組比較，IL-6 mRNA表達(dá)水平分別升高到1.292±0.359、1.988±0.743、2.712±0.801 (p<0.01)（圖2(a)）；IL-8 mRNA的表達(dá)水平分別升高到1.511±0.483、2.896±1.700、5.333±1.997 (p<0.01)（圖2(b)）。IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的表達(dá)水平隨著受照劑量的增加逐步增高，且與對(duì)照組比較，細(xì)胞經(jīng)照射后IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的表達(dá)水平升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 中波紫外線輻照誘導(dǎo)HUVECs中JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3蛋白水平的表達(dá)

HUVECs細(xì)胞經(jīng)40 J/m2紫外照射后，JAK1蛋白表達(dá)水平由對(duì)照組的0.426±0.009升高至0.880 ±0.009、p-JAK1蛋白表達(dá)水平由對(duì)照組的0.275± 0.008升高至0.774±0.011、STAT1蛋白表達(dá)水平由對(duì)照組的0.355±0.009升高至0.898±0.016、p-STAT1蛋白表達(dá)水平由對(duì)照組的0.133±0.006升高至0.554±0.012、p-JAK2蛋白表達(dá)水平由對(duì)照組的0.733±0.010升高至1.173±0.040、p-STAT3蛋白表達(dá)水平由對(duì)照組的0.244±0.006升高至0.918 ±0.017（表2）。

細(xì)胞經(jīng)10、20、40 J/m2紫外照射后，JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、p-JAK2、p-STAT3蛋白隨受照劑量的增加蛋白表達(dá)水平均升高（圖4），與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)（表2）。

然而由圖3可見，細(xì)胞經(jīng)10、20、40 J/m2紫外線照射后JAK2和STAT3的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均無明顯變化（圖3），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)（表2）。

表2　中波紫外線輻照誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3蛋白水平的灰度值Table 2　Expression of JAK1, p-JAK1, JAK2, p-JAK2, STAT1, p-STAT1, STAT3, p-STAT3 in HUVECs irradiated with UVB

3 討論

目前，紫外對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的輻照損傷機(jī)制主要包括DNA損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等，其中TNF-α、VCAM-1[6]、NF-kB、γ-H2AX[7]等分子可能參與損傷的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)，紫外輻照引起血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的表達(dá)上調(diào)，通過激活炎癥因子誘導(dǎo)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。研究顯示，紫外輻射可以引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)大部分是由于表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞間的相互作用，通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的。炎癥因子是內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)外界損傷刺激產(chǎn)生正常免疫反應(yīng)的產(chǎn)物[8]，其中IL-6是炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫的多向性細(xì)胞因子[9]，參與多種疾病的病理過程，在不同組織中通過復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等[10]。IL-8的主要生物作用是激活中性粒細(xì)胞，參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老進(jìn)程[11]。

JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條應(yīng)激反應(yīng)通路，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、成熟、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程[12-15]，是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一。JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是細(xì)胞膜上的細(xì)胞因子受體與相應(yīng)的配體結(jié)合，形成同源或異源二聚體，使得與受體偶聯(lián)的JAKs相互接近并通過交互的酪氨酸磷酸化而活化，活化的JAKs催化受體本身的酪氨酸磷酸化并形成相應(yīng)的STATs?？课稽c(diǎn)，使STATs通過SH2結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合并在JAKs作用下實(shí)現(xiàn)磷酸化活化，然后STATs形成同源或異源二聚體并入核，與相應(yīng)的靶基因啟動(dòng)子結(jié)合而激活相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[16]。我們發(fā)現(xiàn)，紫外照射血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)JAK1和STAT1的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)激活磷酸化的JAK1、JAK2、STAT1、STAT3，但對(duì)JAK2和STAT3蛋白的影響不明顯。研究表明，IL-6可激活JAK-STAT信號(hào)通路中的STAT1和STAT3，引發(fā)慢性炎癥[17-18]，導(dǎo)致機(jī)體生理病理改變。不是所有的炎癥因子都激活相同的STATs，JAKs與STATs之間也并不存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，即一種細(xì)胞因子可激活多種胞內(nèi)JAK-STATs，或多種細(xì)胞因子同時(shí)激活相同JAK-STATs，或是激活的程度有不同差異來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[2]。

細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是復(fù)雜的，由多條通路相互作用起效。本研究結(jié)果表明，紫外對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的輻照損傷可能是通過誘導(dǎo)炎癥因子IL-6 和IL-8的產(chǎn)生，進(jìn)一步激活JAK-STAT信號(hào)通路來發(fā)揮輻照損傷的生物效應(yīng)。然而，JAK-STAT信號(hào)通路的下游調(diào)控基因或旁信號(hào)通路是否也參與輻照損傷的調(diào)控作用有待更深入的研究。

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Effect of UVB irradiation on JAK-STAT pathway and IL-6, L-8 in Human umbilical vein endothelial cells

YU Jing ZHANG Yi DIAO Bo
(Department of Pharmacy, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, China)

ABSTRACTHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were irradiated with different doses (10, 20 and 40 J/m2) to investigate the role of JAK-STAT pathway and IL-6, IL-8 in UVB irradiation. After 24 h, the expression level of IL-6 mRNA and IL-8 mRNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR, and that of JAK1, JAK2, STAT1, STAT3, p-JAK1, p-JAK2, p-STAT1 and p-STAT3 was measured by Western-blot. Compared with the control group, the expression level of IL-6 mRNA and IL-8 mRNA increased, and that of JAK1, STAT1, p-JAK1, p-STAT1, p-JAK2 and p-STAT3 increased with the dose of UVB, except JAK2 and STAT3. It can be concluded that JAK-STAT pathway and IL-6 together with IL-8 play a role in HUVECs with UVB irradiation.

KEYWORDSUVB, Human umbilical vein endothelial cell, JAK-STAT pathway, IL-6, IL-8

Corresponding author:ZHANG Yi, chief pharmacist, E-mail: abcd1566@sina.com

收稿日期：初稿2015-12-03；修回2016-01-24

通訊作者：張宜，碩士研究生，主任藥師，E-mail: abcd1566@sina.com

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020204

中圖分類號(hào)TL7