肖 瀟馬 云肖方竹唐 艷楊 奇黃 波唐 旻何淑雅,

1（南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室 衡陽 421001）2（南華大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 衡陽 421001）

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耐輻射奇球菌pprI和pprA基因在真核細(xì)胞293T中的表達(dá)

肖 瀟1馬 云2肖方竹1唐 艷1楊 奇2黃 波1唐 旻2何淑雅1,2

1（南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室 衡陽 421001）
2（南華大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 衡陽 421001）

摘要以pGADT-7-pprA、pet28a-pprI載體為模板，構(gòu)建pEGFP-N1-pprA、 pDsRed1-N1-flag-pprI真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體2000介導(dǎo)將兩個(gè)重組載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳顯示在4 700、1 000 bp處與4 800、1 100 bp處出現(xiàn)目的條帶。測序結(jié)果顯示構(gòu)建序列與模板序列一致，氨基酸序列100%正確。熒光顯微鏡下見到紅色和綠色熒光；Western blot結(jié)果顯示在不同檢測水平65 kDa及60 kDa大小處有融合蛋白表達(dá)。結(jié)果提示pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag- pprI真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并在離體293T細(xì)胞中共同表達(dá)蛋白。證明原核基因pprI、pprA能夠在真核細(xì)胞中共表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DR菌高抗性基因pprA、pprI及其產(chǎn)物在輻射調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的相互作用和協(xié)同作用、提高真核細(xì)胞的輻射抗性提供了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞耐輻射奇球菌，pprI，pprA，真核細(xì)胞，脂質(zhì)體2000

基金資助：國家自然基金項(xiàng)目(81272993)、湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目(13C805)、湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2015JC3080）、湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2013B398)、衡陽市科技局資助項(xiàng)目(2014KJ10)資助

第一作者：肖瀟，女，1989年4月出生，2012年畢業(yè)于湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，現(xiàn)為南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院特種醫(yī)學(xué)（放射）專業(yè)研究生，E-mail：794171254@qq.com；共同第一作者：馬云，女，1975年4月出生，2004年于南華大學(xué)獲碩士學(xué)位，副教授

Supported by the National Natural Science Foundation of China (81272993), Education Department Scientific Research of Hunan Province (13C805), Key Program of Hunan Provincial Department of Science and Technology (2015JC3080), Graduate Student

Research Innovation Project of Hunan Province (CX2013B398), and Project of Hengyang Municipal Science and Technology Bureau(2014KJ10)

First author: XIAO Xiao (female) was born in April 1989 and graduated from Clinic Medicine of Hunan Normal University Medical Department. Now she is a master candidate at University of South China. Equally contributing author: MA Yun (female) was born in April 1975 and received her master degree from University of South China in 2004, associate professor

CLC Q691, TL71

隨著核能和放射技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，各種突發(fā)輻射狀況和放射治療過程中都可能導(dǎo)致不同程度的輻射損傷，而真核生物對輻射的抵抗作用十分有限。耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, DR)是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的對輻射抗性最強(qiáng)的生物之一，這種原核生物能夠在指數(shù)生長期耐受高達(dá)12～20 kGy的急性電離輻射損傷，并且在劑量率高達(dá)60 kGy/h的慢性照射下仍不會誘發(fā)突變[1]。pprA是DR菌在輻射壓力下響應(yīng)的一種DNA修復(fù)基因[2]，pprA基因產(chǎn)物是DR菌抵抗輻射所必須的[3]。pprI是DR修復(fù) DNA 損傷、發(fā)揮輻射抗性的關(guān)鍵基因，是輻射抗性機(jī)制的總開關(guān)[4]，它在受到電離輻射的刺激后上調(diào)表達(dá)，并可以通過調(diào)節(jié) recA、pprA等的表達(dá)顯著提高DR 菌中CAT 的活性，從而提升對氧化劑的耐受，提高菌株的存活率[5]。本研究構(gòu)建真核熒光表達(dá)載體，將DR菌高效抗輻射基因共轉(zhuǎn)染腎上皮細(xì)胞293T，證實(shí)其能夠在離體真核細(xì)胞中共同表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這兩個(gè)基因提高真核細(xì)胞對輻射的抵抗能力提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

耐輻射球菌Deinococcus radiodurans R1來自本實(shí)驗(yàn)室保種；pGADT-7-pprA、 pet28a-pprI重組表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；熒光表達(dá)載體pEGFP-N1、pDsRed1-N1實(shí)驗(yàn)室保存；DNA marker、2x Taq Master Mix、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（康為世紀(jì)）；T4 DNA連接酶、BamH I、EcoR I限制性內(nèi)切酶（Fermentas公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（OMEGA公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）；引物合成及測序（南京金斯瑞科技有限公司）；細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季清生物技術(shù)有限公司）；293T細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 真核載體構(gòu)建

利用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，pprI基因兩端分別加入EcoR I、BamH I酶切位點(diǎn)，5’端加入一個(gè)Flag標(biāo)簽。pprA基因兩端分別加入EcoR I、BamH I酶切位點(diǎn)。pprI-F：

利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pGADT-7-pprA、pet28a-pprI為模板，進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃，5min，變性94℃，45s，退火53℃(pprI) /59℃(pprA)，30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收獲得pprI、pprA基因片段。利用EcoR I、BamH I分別雙酶切回收的pprI、pprA及pEGFP-N1、pDsRed1-N1空質(zhì)粒，37℃酶切2 h后利用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。CaCl2法將連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后涂布于Kan抗性的LB固體平板上進(jìn)行篩選，置于37℃生化恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，篩選陽性菌落。提質(zhì)粒，用EcoR I、BamH I進(jìn)行雙酶切鑒定，挑選陽性克隆菌液進(jìn)行測序分析。

1.2.2 293T細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞在含10% FBS及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

職前教師根據(jù)自己設(shè)計(jì)的關(guān)于“空氣質(zhì)量問題”的教學(xué)方案，以少數(shù)同學(xué)為授課對象，在10~15分鐘的時(shí)間內(nèi)，嘗試小型課堂教學(xué)，并將其教學(xué)過程錄制下來．

1.2.3 基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

質(zhì)粒pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI 經(jīng)Invitrogen公司的LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：按照Lip2000說明書中的操作步驟，1:1比例配制重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000的混合轉(zhuǎn)染液，將轉(zhuǎn)染液一滴一滴地加入各瓶細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，將無抗無血清培養(yǎng)基換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h左右熒光顯微鏡觀察紅色和綠色熒光，拍照。

1.2.4 Western blot驗(yàn)證融合蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞提取蛋白，經(jīng)過細(xì)胞裂解，BCA法測定蛋白濃度，分離膠濃度Flag檢測指標(biāo)為10%，GFP指標(biāo)濃度為12%。SDS-PAGE膠電泳2 h后轉(zhuǎn)膜1 h，封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，顯色，攝片，將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建

2.1.1 目的基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

PCR擴(kuò)增pprI、pprA基因，1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在1 000、1 100 bp處可見特異性條帶，與預(yù)期基因片段實(shí)際大小987、1 100 bp一致（圖1和圖2）。

2.1.1 雙酶切產(chǎn)物電泳鑒定

EcoR I、BamH I酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定見圖3，在4700、1000bp左右有目的條帶。圖4中在約4800、1100 bp處有目的條帶，與預(yù)期一致。

2.1.2 測序鑒定分析

陽性的質(zhì)粒進(jìn)一步測序驗(yàn)證，所得的序列在NCBI中進(jìn)行序列比對，顯示構(gòu)建序列與模板基因堿基序列完全一致，氨基酸序列100%正確，pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-ppr1構(gòu)建成功。測序結(jié)果見圖5和圖6。

2.2 pprI和pprA基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

2.2.1 熒光顯微鏡熒光拍照

pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI重組熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T后24 h可觀察到紅色和綠色熒光，48 h左右達(dá)到最大，見圖7。

2.2.2 Western blot驗(yàn)證融合蛋白表達(dá)

如圖8和圖9所示，1～5泳道分別為空白對照組、pDsRed1-N1空載體轉(zhuǎn)染組、pprI基因轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染組、pprI、pprA雙基因共轉(zhuǎn)組。第5泳道可在GFP及Flag檢測水平見到60 kDa 和65 kDa大小條帶，為重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所表達(dá)融合蛋白。

3 討論

隨著核能的廣泛利用以及放射技術(shù)的不斷發(fā)展，人類越來越關(guān)注輻射安全和防護(hù)，核輻射對環(huán)境和健康的影響日漸成為科學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。為了滿足各類放射診斷和治療的需要，提高輻射突發(fā)事件的應(yīng)急處理，尋找提高輻射抗性的方法預(yù)防或者治療輻射損傷非常有必要。在低劑量（幾戈瑞）輻照下，人和大部分脊椎動物都將面臨滅頂之災(zāi)，而耐輻射奇球菌卻能夠在超過15 kGy的γ-射線輻照下生長[6]，相當(dāng)于大腸桿菌的250倍，人類耐受劑量的3000多倍[7]，有報(bào)道稱其最高可耐受50 kGy的劑量。耐輻射奇球菌究竟是怎樣在缺少一條完整模板的情況下，精確地從由輻射導(dǎo)致的數(shù)以百計(jì)的碎片中重組其基因組，這個(gè)謎底仍未確知；一般認(rèn)為，耐輻射奇球菌并不具有特別的免受輻射損傷的能力，但是它能夠在12～24 h修復(fù)每條染色體的100～200個(gè)DSBs[8-9]，并精確重組其基因組。這種高效精確的DNA修復(fù)能力主要得益于DR菌超強(qiáng)的輻射抗性基因。pprI基因是Earl等[10]發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個(gè)具有保護(hù)作用的開關(guān)基因，是DR菌所特有的，陸續(xù)有研究將pprI轉(zhuǎn)染入大腸桿菌等原核生物，煙草、油菜等植物以及酵母菌、人肺上皮細(xì)胞等真核生物中，以提高生物的輻射抵抗能力。楊占山[11]課題組還利用電轉(zhuǎn)染的方法將pprI基因轉(zhuǎn)入活體小鼠，救治其γ-射線損傷。作為一個(gè)輻射調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，pprI還被應(yīng)用于放射性廢液的處理、提高油菜的產(chǎn)量等。pprA是1998年由杜澤吉[12]發(fā)現(xiàn)并克隆的，對促進(jìn)DR菌DSBs的修復(fù)，保持基因組完整性具有重要作用。其突變株在受到DNA損傷攻擊后生長遲緩明顯，且無核突變高[3]，而其回補(bǔ)株能夠恢復(fù)對γ射線輻照的抗性，pprA的基因產(chǎn)物是DR輻射抵抗所必須的[13]。最近研究證明，pprA基因?qū)ψ贤廨椛浜徒z裂霉素C也有抵抗作用[14]。pprI通過調(diào)控recA、pprA等基因的表達(dá)來增強(qiáng)輻射保護(hù)作用[10]，但pprA、pprI基因及其產(chǎn)物是否具有協(xié)同抗輻射的作用，在真核生物中能否共同表達(dá)蛋白產(chǎn)物，基因共轉(zhuǎn)染比單轉(zhuǎn)能否呈現(xiàn)更好的輻射抵抗效果目前仍然未知，故本研究構(gòu)建pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI載體，將DR菌重要的抗輻射基因pprA、pprI共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。選擇綠色熒光和紅色熒光蛋白載體以便更好的觀察轉(zhuǎn)染效果。由于DR菌這兩個(gè)基因尚無抗體購買，選擇載體所帶的GFP和插入的flag標(biāo)簽檢測蛋白的表達(dá)。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法是目前條件下最方便且轉(zhuǎn)染效率較高的方法之一，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞貼壁率70%左右最佳，選用去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提高轉(zhuǎn)染DNA純度對實(shí)驗(yàn)成功具有重要作用，脂質(zhì)體和DNA的量保持1:1的比例在本實(shí)驗(yàn)中最佳，轉(zhuǎn)染時(shí)使用無血清無抗生素的培養(yǎng)基也至關(guān)重要。本研究成功構(gòu)建綠色和紅色熒光表達(dá)載體，將原核生物的pprA、pprI基因轉(zhuǎn)染離體真核細(xì)胞并成功共表達(dá)蛋白，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提高真核細(xì)胞的輻射抵抗、損傷修復(fù)能力，驗(yàn)證DR菌高抗性基因

pprA、pprI及其產(chǎn)物在輻射調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的共同作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Received 25 January 2016; acceppted 22 Feburary 2016
Expression of pprI and pprA genes from deinococcus radiodurans in eukaryotic 293T cells

XIAO Xiao1MA Yun2XIAO Fangzhu1TANG Yan1YANG Qi1TANG Min2HE Shuya1,21(Department of Radiation Medicine, School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, China)

2(Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of South China, Hengyang 421001, China)

ABSTRACTTo construct fluorescence expression plasmids pEGFP-N1-pprA and pDsRed1-N1-flag-pprI, pGADT-7-pprA and pet28a-pprI plasmid constructed at an earlier laboratory stage was used as the template, and Lipofectamine 2000 was employed to transfect two recombinant vectors into 293T cells. A fluorescent microscope was used for Fluorescence observation, and Western blot was employed to examine the expression of the fusion protein. Double digestions and the agarose gel electrophoresis showed that target bands appeared at 4700 bp and 1000 bp, 4 800 bp and 1100 bp. No apparent frameshift mutation occurred as shown in the sequencing results. The fluorescent microscopy showed red and green phosphors; the Western blot results indicated protein expression at 65book=66,ebook=35kDa and 60 kDa. pDsRed1-N1-flag-pprI and pEGFP-N1-pprA were successfully constructed to express proteins for eukaryotic cells 293T in vitro. The results indicated that prokaryotic genes pprA and pprI could co-express proteins in eukaryotic cells successfully, and laid a foundation for the interaction and synergism of pprA, pprI, and their products in the regulation network of radiation verified by DR, enhancing the radiation resistance of eukaryotic cells.

KEY WORDSDeinococcus radiodurans, pprI, pprA, Eukaryotic cells, Lipofectamine 2000

Corresponding author:Ph.D. HE Shuya, professor, E-mail: heshuya8502@163.com

收稿日期：2016-01-25；修回2016-02-22

通訊作者：何淑雅，博士，教授，E-mail：heshuya8502@163.com

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020206

中圖分類號Q691，TL71