王　凡, 林曉潔, 肖　謐, 陳茹娟, Muhammad Siddiq, 劉　俐

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 新生兒科, 陜西 西安, 710061)

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調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠早產(chǎn)模型胎盤炎癥反應(yīng)的影響

王凡, 林曉潔, 肖謐, 陳茹娟, Muhammad Siddiq, 劉俐

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 新生兒科, 陜西 西安, 710061)

摘要:目的研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠早產(chǎn)模型胎盤炎癥反應(yīng)的影響。方法孕17 d小鼠分組為腹腔注射PBS組(Control組)，腹腔注射LPS(LPS組)，腹腔注射LPS并尾靜脈注射PBS組(LPS+PBS組)，腹腔注射LPS并尾靜脈注射Treg組(LPS+Treg組)。構(gòu)建LPS腹腔注射誘導(dǎo)的17 d孕小鼠早產(chǎn)模型。在第2劑LPS注射后1、6、12 h及出生時(shí)留取胎盤組織，檢測(cè)Treg細(xì)胞標(biāo)志物叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)、白血病抑制因子(LIF)、血紅素加氧酶-1(HO-1)和白介素 6(IL-6) mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果① LPS組早產(chǎn)率100%，Control組未發(fā)生早產(chǎn)，LPS+Treg組早產(chǎn)率與LPS組和LPS+PBS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。② LPS組與LPS+PBS組胎盤組織中Foxp3、HO-1、LIF在第二劑LPS注射后1、6、12 h及出生時(shí)表達(dá)顯著下降，IL-6表達(dá)顯著增高；LPS+Treg組Foxp3、HO-1、LIF表達(dá)明顯增高，IL-6表達(dá)顯著降低。結(jié)論在LPS腹腔注射誘導(dǎo)的早產(chǎn)小鼠模型中，胎盤組織Treg減少可能是早產(chǎn)的機(jī)制之一，HO-1、LIF參與了Treg在母胎界面維持的獨(dú)特的免疫微環(huán)境；Treg過繼治療可通過降低IL-6的表達(dá)減輕胎盤組織炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞:叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子; 脂多糖; 早產(chǎn); 胎盤; 小鼠模型

感染是早產(chǎn)的主要原因，它可以激活孕母及胎兒的炎癥反應(yīng)[1]。胎兒作為一種半同種異體移植物植入母體并不被母體免疫系統(tǒng)排斥，其中妊娠的免疫耐受機(jī)制起重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在母胎界面介導(dǎo)一個(gè)特殊的免疫微環(huán)境，使母體的免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒產(chǎn)生免疫耐受，維持胎兒正常生長(zhǎng)，母胎界面Treg細(xì)胞減少是早產(chǎn)的機(jī)制之一[2-3]。Treg細(xì)胞發(fā)育及功能失調(diào)，與多種重大免疫相關(guān)性疾病有關(guān)[4]，其中叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)為CD4+CD25+Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志，在Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持中起著重要作用[5-6]。孕母Treg細(xì)胞不僅被證明與流產(chǎn)和早產(chǎn)密切相關(guān)，而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明在胚胎著床期，即孕0～4 d，孕鼠注射Treg細(xì)胞可以完全阻止早產(chǎn)的發(fā)生[7]。雖然Treg細(xì)胞在自發(fā)性早產(chǎn)發(fā)生中的角色已被證實(shí)，但Treg細(xì)胞在孕晚期宮內(nèi)感染誘導(dǎo)早產(chǎn)中的作用機(jī)制仍不明確，對(duì)其作用機(jī)制的研究將為預(yù)防或治療宮內(nèi)感染相關(guān)早產(chǎn)提供新的靶點(diǎn)。本研究擬以脂多糖(LPS)腹腔注射17 d孕鼠為研究對(duì)象，構(gòu)建宮內(nèi)感染誘導(dǎo)早產(chǎn)模型，并選孕14 d小鼠脾臟Treg細(xì)胞，尾靜脈注射，探討宮內(nèi)感染17 d孕鼠胎盤組織Treg細(xì)胞以其相關(guān)因子在Treg細(xì)胞治療前后的變化。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象及分組

1.1.1模型構(gòu)建: ① 小鼠來源：清潔級(jí)Balb/C雌鼠，體質(zhì)量20～25 g，C57雄鼠，體質(zhì)量25～30 g，8～10周，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，每日日照12 h。以雌∶雄=2∶1合籠飼養(yǎng)，每日晨8：00檢查雌鼠陰道情況，如見到明顯陰道栓，則可確認(rèn)受孕，見栓當(dāng)日計(jì)為孕0 d。② 動(dòng)物分組：每15只孕鼠隨機(jī)分為一組，共4組，即腹腔注射PBS組(Control組)，腹腔注射LPS(LPS組)，腹腔注射LPS+尾靜脈注射PBS組(LPS+PBS組)，腹腔注射LPS+尾靜脈注射Treg組(LPS+Treg組)。在注射第2劑LPS后1、6、12 h及出生時(shí)留取胎盤組織。前3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各3只孕鼠，出生時(shí)各6只孕鼠。③ LPS誘導(dǎo)宮內(nèi)感染早產(chǎn)模型的構(gòu)建：雌鼠孕齡17 d時(shí)，分別于下午2時(shí)和5時(shí)腹腔注射LPS(LPS，E．coli，serotype 055：B5；Sigma)，劑量50 μg/kg。

1.1.2Treg細(xì)胞磁珠分選：從14 d相同種系正常孕鼠脾臟提取單細(xì)胞懸液，利用CD4+CD25+Foxp3 Treg磁珠分選試劑盒(購(gòu)自德國(guó)美天旎公司)進(jìn)行Treg 細(xì)胞的分選，取分選后的Treg細(xì)胞用CD4-FITC(購(gòu)自德國(guó)美天旎公司)進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選后的Treg細(xì)胞濃度大于90%。以2×105/200 μL PBS個(gè)Treg 細(xì)胞對(duì)小鼠尾靜脈注射。

1.2方法

1.2.1小鼠實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的釆集：孕鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，打開腹腔，分離每個(gè)胎盤，將分離的完整胎盤組織放入預(yù)先盛有預(yù)冷無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿清洗3遍，標(biāo)記后迅速放入液氮，2 d后轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱，Western blot和RT-PCR備用。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)胎盤組織Foxp3、血紅素加氧酶(HO-1)、白血病抑制因子(LIF)、IL-6 mRNA的表達(dá)情況：胎盤從-80 ℃冰箱中取出，稱重25～30 mg組織，放入無菌無酶的一次性勻漿器中勻漿。按照Tissue RNA Prep kit(OMEGA 美國(guó))和PrimeScriptTMRT MasterMix(TaKaRa 日本)操作說明抽提和逆轉(zhuǎn)錄RNA。紫外分光光度儀檢測(cè)抽提總RNA的濃度和純度，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)RNA樣品A260/A280比值為1.8～2.0，濃度350～500 ng/μL。Bio-Rad CFX Manager 進(jìn)行RT-PCR，SYBR R Premix Ex TaqTM(TaKaRa日本)為檢測(cè)標(biāo)志，反應(yīng)體系為 10 μL。反應(yīng)條件：第一步：95 ℃，30 s; 第二步：40個(gè)循環(huán)，95℃，15 s，60 ℃，30 s。引物序列TaKaRa生物公司合成序列如下: Foxp3: 正義5′-AGGGCCAGCATAGGTGCAAG-3′, 反義5′-AGTGCCTGTGTCCTCAATGGTC-3′; HO-1: 正義 5′-CTGGAGATGACACCTGAGGTCAA-3′, 反義5′-CTGACGAAGTGACGCCATCTG-3′; LIF: 正義5′-AAGAATCAACTGGCACAGCTCAA-3′, 反義5′- AGGTATGCGACCATCCGATACA-3′; IL-6: 正義5′-CAACGATGATGCACTTGCAGA-3′, 反義5′-CTCCAGGTAGCTATGGTACTCCAGA-3′; 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)1: 正義5′-TACGGCAGTGGCTGAACCAA-3′, 反義5′-CGGTTCATGTCATGGATGGTG-3′。

1.2.3Western-Blot技術(shù)檢測(cè)各組中小鼠胎盤組織中FOXP3、HO-1、LIF以及干擾素-6(IL-6)蛋白的表達(dá)水平：按照RIPA(西安赫特生物科技有限公司)和Bradford protein assay reagent(Bio-Rad)操作說明抽提總蛋白并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。根據(jù)蛋白定量上樣，變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，膜在10%脫脂奶粉溶液中室溫孵育3～4 h以封閉膜上的非特異結(jié)合。用兔抗小鼠Foxp3抗體(1∶1 000 CST)、兔抗小鼠HO-1抗體(1∶200，SNATA)、兔抗小鼠LIF抗體(1∶100, SNATA)、兔抗小鼠TGF-β1抗體(1∶200, SNATA)、兔抗小鼠IL-6抗體(1∶200，SNATA)4 ℃ 孵育過夜。洗去一抗，再與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔Ig G(1∶3 000)反應(yīng)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X 線底片曝光顯影。以穩(wěn)定表達(dá)的基因 β-actin作為內(nèi)參照。

2結(jié)果

2.1Treg治療對(duì)LPS誘導(dǎo)孕鼠早產(chǎn)發(fā)生率的影響

LPS組所有孕鼠均在第2劑量LPS后24 h內(nèi)出現(xiàn)早產(chǎn)，即孕18 d 7∶00～11∶00早產(chǎn)，早產(chǎn)率為100%; Control組孕鼠均在孕19 d以后分娩，早產(chǎn)率為0%; LPS+PBS組孕鼠均在第2劑量LPS后24 h內(nèi)出現(xiàn)早產(chǎn)，早產(chǎn)率為100%; LPS+Treg組5只于孕18 d早產(chǎn), 1例孕19 d分娩，早產(chǎn)率為83%。LPS+Treg組早產(chǎn)率與LPS組和LPS+PBS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2Treg治療對(duì)胎盤組織中Foxp3表達(dá)的影響

4組Foxp3 mRNA和蛋白水平的表達(dá)在出生時(shí)降至最低點(diǎn)，且各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LPS組Foxp3 mRNA和蛋白水平的表達(dá)在第2劑LPS注射后1、6、12 h均顯著低于Control組(P<0.001); LPS+Treg組Foxp3 mRNA和蛋白水平的表達(dá)在第2劑LPS注射后1、6、12 h均顯著高于LPS組和LPS+PBS 組(P<0.001)，與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

**P<0.01, ***P<0.001, ****P< 0.0001

圖1胎盤組織Foxp3 mRNA 和蛋白水平的表達(dá)

2.3Treg治療對(duì)胎盤組織中HO-1、LIF表達(dá)的影響

LPS組胎盤組織HO-1、LIF mRNA和蛋白水平表達(dá)在第2劑LPS注射后1、6、12 h均顯著低于Control組(P<0.001); LPS+Treg組HO-1、LIF的mRNA和蛋白水平表達(dá)在第2劑LPS注射后1、6、12 h均顯著高于LPS組和 LPS+PBS 組(P<0.05), 與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在出生時(shí)HO-1、LIF的表達(dá)各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.4Treg治療對(duì)胎盤組織IL-6表達(dá)的影響

LPS組和LPS+PBS組胎盤組織IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)在1、6、12 h和出生時(shí)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01); LPS+Treg組IL-6 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)1、6、12 h和出生時(shí)顯著低于LPS組和LPS+PBS組(P<0.05，P<0.01); 而與Control組在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

3討論

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Treg在妊娠中作用的研究絕大部分是以小鼠自發(fā)性早產(chǎn)模型為研究對(duì)象，而對(duì)于導(dǎo)致早產(chǎn)的最主要原因，即宮內(nèi)感染誘導(dǎo)早產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制研究很少。為探討LPS誘導(dǎo)小鼠早產(chǎn)時(shí)Treg的作用和功能，本研究利用雜交孕17 d的Balb/C小鼠成功構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的早產(chǎn)模型，以雜交孕14 d的Balb/C小鼠脾臟的Treg作為干預(yù)手段，觀察不同組別、時(shí)間點(diǎn)胎盤組織Foxp3、HO-1、LIF及IL-6的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS腹腔注射誘導(dǎo)早產(chǎn)時(shí)，胎盤組織Foxp3、HO-1、LIF mRNA 和蛋白的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，并且這些指標(biāo)在LPS干預(yù)后6 h開始降低，12 h至最低，與出生時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果與早產(chǎn)發(fā)生的時(shí)間基本一致。LPS組在第2劑LPS干預(yù)后12 h，即孕18 d 早上5時(shí)沒有發(fā)生早產(chǎn)，但于孕18 d 7∶00～11∶00開始出現(xiàn)早產(chǎn); Treg細(xì)胞在第1劑LPS腹腔注射前1 h通過尾靜脈注入孕鼠體內(nèi)，LPS+Treg組胎盤組織Foxp3、HO-1、LIF mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯高于LPS組，但并未降低LPS誘導(dǎo)的早產(chǎn)率。這可能是由于：首先Treg在妊娠中的起源、擴(kuò)增、遷移及功能是非常復(fù)雜的[8-9]，妊娠時(shí)許多免疫細(xì)胞如母胎界面的T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞及巨噬細(xì)胞被激活后產(chǎn)生趨化因子，參與Treg的遷移和免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮；其次，已有實(shí)驗(yàn)[10]證明Treg對(duì)于胎盤植入是具有關(guān)鍵作用，而Treg治療對(duì)于懷孕后4～5 d的小鼠早產(chǎn)模型是無效的；再者，宮內(nèi)感染導(dǎo)致的早產(chǎn)是非常復(fù)雜的免疫反應(yīng)。因此，不能把研究Treg在LPS誘導(dǎo)早產(chǎn)的功能僅僅局限在觀察它對(duì)早產(chǎn)率的影響上。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001

圖3胎盤組織 IL-6 mRNA 和蛋白水平的表達(dá)

IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，在許多炎癥情況下IL-6都作為關(guān)鍵的炎性因子表達(dá)上調(diào)，羊水中IL-6表達(dá)增高與早產(chǎn)兒腦損傷密切相關(guān)；另一方面，IL-6也可作為抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，抑制某些自身免疫性疾病的炎癥反應(yīng)[11-12]。LIF是一種具有多種生物學(xué)功能的分泌型糖蛋白，它可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞，防止組織損傷[12], 人類和鼠類實(shí)驗(yàn)證明，LIF在胎盤著床期間起著重要作用[13]，它的正常表達(dá)與胎盤的成功植入有關(guān)[14]。HO-1作為唯一的誘導(dǎo)型的HO，它分解血紅色為一氧化碳(CO)、膽綠素和游離鐵，CO和膽紅素(膽綠素的分解產(chǎn)物)均有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及細(xì)胞保護(hù)作用[15-16]。Zenclussen等[17]發(fā)現(xiàn)在流產(chǎn)小鼠的胎盤HO-1表達(dá)明顯降低，而且HO-1表達(dá)減少與早期胚胎死亡有關(guān)。若母胎界面HO-1表達(dá)減少，就會(huì)導(dǎo)致血紅素增多，其中大部分血紅素進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞引起氧化損傷，促進(jìn)黏附分子的產(chǎn)生，減少CO的產(chǎn)生，低水平表達(dá)的CO可以通過促進(jìn)抗炎基因的表達(dá)和抑制抗炎因子的產(chǎn)生而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)LPS腹腔注射可引起胎盤組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致Foxp3、HO-1、LIF表達(dá)降低，IL-6表達(dá)增高，這可能是LPS誘導(dǎo)早產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制之一。而Treg治療后Foxp3、HO-1、LIF表達(dá)增高，IL-6表達(dá)降低，胎盤組織的炎癥反應(yīng)減輕。但這是否有益于機(jī)體，還需要大量的研究，一方面, Treg參與機(jī)體對(duì)抗病原體的免疫反應(yīng)的利弊，與病原體的種類、參與的時(shí)間點(diǎn)以及急性或慢性感染有關(guān)；另一方面, Treg在感染過程中起到雙重作用，它參與了多數(shù)或全部的宿主對(duì)病原體感染的免疫反應(yīng)，抑制過度免疫反應(yīng)造成的組織損傷，這在多數(shù)慢性感染中對(duì)宿主是有利的，但其也會(huì)抑制宿主對(duì)病原體感染發(fā)揮有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，不利于宿主對(duì)病原體的及時(shí)清除。

綜上所述，在LPS腹腔注射誘導(dǎo)的早產(chǎn)小鼠中，Treg參與了宮內(nèi)感染誘導(dǎo)早產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制、胎盤組織HO-1、LIF參與了Treg在母胎界面維持的獨(dú)特的免疫微環(huán)境；Treg體內(nèi)注射可以減少宮內(nèi)感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，為深入了解宮內(nèi)感染誘導(dǎo)早產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制提供了新方向，為治療宮內(nèi)感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)開闊了新思路。

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Effect of regulatory T cells on placental inflammation in lipopolysaccharide-induced preterm delivery mouse models

WANG Fan, LIN Xiaojie, XIAO Mi, CHEN Rujuan, Muhammad Siddiq, LIU Li

(DepartmentofNeonatology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi, 710061)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of the regulatory T cells on placental inflammation in lipopolysaccharide (LPS)-induced preterm delivery mouse models. MethodsThe 17-day-old pregnant mice were divided into phosphate buffer saline (PBS) group (control group) with intraperitoneal injection of PBS, LPS group with intraperitoneal injection of LPS, LPS+PBS group with intraperitoneal injection of LPS and tail vein injection of PBS, and LPS+Treg group with intraperitoneal injection of LPS and tail vein injection of PBS. LPS-induced preterm delivery models of 17-day-old pregnant mice were established. Placenta tissues were taken for detecting the expression levels of forkhead/winged helix transcription factor (Foxp3), leukemia inhibitory factor (LIF), heme oxygenase-1 (HO-1) and interleukin 6 (IL-6) 1, 6, 12 h after the second injection of LPS and at birth. ResultsPremature delivery rate was 100% in LPS group and 0% in control group. There was no significant difference between LPS+Treg group and LPS+PBS group (P>0.05). The expression levels of Foxp3, HO-1, and LIF decreased significantly, while the level of IL-6 increased significantly in LPS group and LPS+PBS group. The expression levels of Foxp3, HO-1, LIF increased significantly in LPS+Treg group, and the expression level of IL-6 decreased significantly 1, 6, 12 h after the second injection of LPS and at birth. ConclusionIn LPS-induced preterm delivery mouse models, decreasing of the placenta tissue Tregs might be one of mechanisms of premature delivery, HO-1 and LIF participate in the unique immune microenviroment kept by Tregs in maternal-fetal interface. Tregs adoptive therapy can relieve the inflammation reaction of placenta tissue by lowering the expression level of IL-6.

KEYWORDS:forkhead/winged helix transcription factor; lipopolysaccharide; placenta; mouse model

中圖分類號(hào):R 321.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)07-010-05

DOI:10.7619/jcmp.201607003

通信作者:劉俐, E-mail: 2432713939@qq. com

基金項(xiàng)目:中國(guó)高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11525914)

收稿日期:2015-12-11