李玉宏　倪書邦　賀熙勇　馬靜

摘 要 為了探索澳洲堅果SSR-PCR的可行性，采用單因素分析法對影響PCR的各個因素進行分析，建立SSR-最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明：在25 μL PCR反應(yīng)體系中，當(dāng)Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶用量分別為2.50 mmol/L、0.10 mmol/L、0.40 μmol/L、1.25 U時，PCR擴增效果最好。篩選到19對可得到擴增結(jié)果的SSR引物，其中有2對在以900為母本、294為父本的組合中PCR擴增結(jié)果存在差異，可以應(yīng)用于900×294組合的F1代鑒定。

關(guān)鍵詞 澳洲堅果 ；分子標(biāo)記 ；SSR

中圖分類號 S664.9 文獻標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.09.007

Abstract In order to explore the feasibility of SSR-PCR in Macadamia， a singular factor test was used to optimize SSR-PCR amplification system for macadamia. The results showed the optimal PCR reaction system was 2.50 mmol/L Mg2+， 0.10 mmol/L dNTPs， 0.40 μmol/L primers， and 1.25 U Taq DNA polymerase in a volume of 25 μL. Nineteen pairs of SSR primers with amplifications were obtained in SSR-PCR， but only two pairs of primers had different results in PCR amplification in the combination of 900 as female and 294 as male parents. These two pairs of primers can hence be used to identify the F1 generation of the 900×294 combination. Therefore the SSR-PCR could be used for identification of hybrid progeny in macadamia.

Keywords Macadamia ； molecular marker ； SSR

澳洲堅果（Macadamia spp.）屬山龍眼科（Proteacase）澳洲堅果屬（Macadamia）常綠喬木。原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭州東南部和新南威爾士州北部、南緯25°～32°之間的沿海亞熱帶雨林[1]。素有“干果之王”的譽稱。中國于20世紀(jì)70 年代引種試種澳洲堅果，在云南、海南、廣東、廣西、福建、浙江等省（區(qū)）引種試種，種植面積近5 400 hm2，產(chǎn)量約600 t，其中種植規(guī)模最大的是云南，其他?。▍^(qū)）還處于零星試種階段[2]。

目前，有關(guān)澳洲堅果性狀的研究主要集中在形態(tài)學(xué)的特征性描述與遺傳多樣性研究。形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記也已應(yīng)用于澳洲堅果的品種鑒定、分類和親緣關(guān)系研究等方面[3-4]。由各種DNA分子標(biāo)記衍生的DNA指紋技術(shù)在鑒定品種等方面具有高效、準(zhǔn)確的特點[5-6]。Steiger等[7-9]利用AFLP技術(shù)在澳洲堅果上檢測到了豐富的多態(tài)性，RAF標(biāo)記表明澳洲堅果種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性[10]；Peace等[8]利用PAPD與SSR對澳洲堅果種質(zhì)進行了遺傳多樣性研究，與其后Vithanage等[9]采用同工酶研究結(jié)果一致，表明DNA標(biāo)記對澳洲堅果的雜交育種有輔助作用。近年來，一些研究顯示DNA分子標(biāo)記應(yīng)用于澳洲堅果中具有高度的一致性和可信度[11]。雖然分子標(biāo)記在澳洲堅果種質(zhì)資源鑒定上的應(yīng)用還處于初步階段，但雜交育種已廣泛應(yīng)用在澳洲堅果選育種中。本課題雖在澳洲堅果雜交育種方面做了大量工作，也得到了大量的雜交子代，但其子代只能使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，完成鑒定必須等到開花結(jié)實，周期長達8 a，耗費大量的人力和財力。為了提高育種效率，迫切需要一種快捷簡易的鑒定方法。而SSR標(biāo)記具有共顯性的特征，原則上子代將同時含有父母本的特征性條帶。為此，本實驗選擇SSR標(biāo)記方法，研究SSR標(biāo)記在澳洲堅果子代鑒定中的可行性。

本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，以900×294組合及其子代為研究對象，采用單因素分析法對影響SSR-PCR的各個因素進行分析，建立SSR-PCR反應(yīng)體系，并初步探討SSR-PCR標(biāo)記在澳洲堅果親本標(biāo)記和雜交子代鑒定方面的可行性，為澳洲堅果分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

采集母本900、父本294及雜交子一代幼葉于液氮中保存。主要試劑有：引物（上海生工合成）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、瓊脂糖、硝酸銀等從上海生工購買；Taq DNA聚合酶等PCR試劑為TAKARA產(chǎn)品；氯仿、異丙醇、無水乙醇、丙三醇、飽和酚等為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用改良CTAB法提取基因組DNA[12]。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

配置1%瓊脂糖膠，核酸染料采用goldviewⅡ，每100 mL加5 μL染料，電泳條件為150 V，30 min，結(jié)束后置于紫外燈下觀察提取的DNA質(zhì)量。

1.2.3 SSR引物的篩選

從NCBI里查找澳洲堅果DNA系列，用SSRHunter 1.3查找到可能的SSR系列，再用primer 5設(shè)計100對引物，送上海生工合成。將合成的引物用滅菌的去離子水溶解至10 μmol/L。采用25 μL PCR反應(yīng)體系，包括10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）2 μL、Primer（10 μmol/L）1 μL、Taq（5 U/μL）0.5 μL、DNA1 μL，用ddH2O補充到25 μL。在確定最適反應(yīng)體系時，在不改變其他組分的條件下，分別對反應(yīng)體系各組分濃度進行調(diào)整。將最終確定的最佳反應(yīng)體系用于SSR引物的篩選。PCR 反應(yīng)為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，最適Tm退火值 30 s；72℃延伸60 s，再重復(fù)2～4步，30個循環(huán)，后于72℃延伸5 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠預(yù)檢測其擴增效果，并用梯度PCR確定每對引物的最適退火溫度。調(diào)整好最適退火溫度，分別以父本、母本為模板再次進行PCR 擴增，PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，找出能區(qū)分父本和母本的特異性引物和擴增結(jié)果良好的引物（聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高）。

1.2.4 F1代鑒定

子代F1和母本900、父本294同時進行PCR擴增（反應(yīng)體系和條件以上面確定的一致），將擴增后的PCR 產(chǎn)物先用瓊脂糖凝膠檢測，以確定PCR擴增是否成功，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，硝酸銀染色后拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅果DNA提取

DNA作為本研究的直接材料，其純度和完整性是進行SSR-PCR試驗的前提條件。本研究采用CTAB法提取DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。從圖1可看出，所得DNA樣本條帶清晰，完整度好，且沒有RNA污染和降解。說明DNA質(zhì)量達到PCR的基本要求。

2.2 確定SSR-PCR擴增的最適Mg2+濃度

由于Taq DNA聚合酶是鎂離子（Mg2+）依賴性酶，因此Mg2+濃度對PCR擴增有顯著影響，在一般的PCR反應(yīng)中，Mg2+的工作濃度為1.5～2.0mmol/L。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴增，但Mg2+濃度過低又會降低Taq DNA聚合酶的活性，得不到擴增產(chǎn)物。本實驗設(shè)計了1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mmol/L共5個濃度梯度。從圖2可看出，各個Mg2+濃度下都可得到清晰的擴增條帶，但Mg2+濃度為2.50 mmol/L時條帶最亮，因此本實驗中最適Mg2+濃度為2.50 mmol/L。

2.3 確定SSR-PCR擴增的最適dNTPs濃度

dNTPs濃度直接影響PCR產(chǎn)物的量，dNTPs濃度過高，會導(dǎo)致聚合酶錯配，過低又會降低PCR擴增效率。在一般PCR體系中，dNTPs濃度為0.1 mmol/L。本實驗選取0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mmol/L 5個dNTPs濃度進行PCR擴增。從圖3可看出，隨著dNTPs濃度的增加，得到的PCR產(chǎn)物量也增加，但當(dāng)dNTPs濃度超過0.1 mmol/L時，PCR產(chǎn)物量的增加不明顯，因此本實驗中最適dNTPs濃度為0.1mmol/L。

2.4 確定SSR-PCR擴增的最適引物濃度

引物濃度直接影響PCR擴增結(jié)果，引物的濃度太低時，擴增產(chǎn)物量太少，但引物濃度太高時，比較容易出現(xiàn)非特異性擴增反應(yīng)。PCR中引物的濃度一般在0.1～1.0 μmol/L。因此本實驗選擇0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L 5個濃度。從圖4可看出，當(dāng)引物濃度為0.4 μmol/L時，SSR-PCR的效果最好。

2.5 確定SSR-PCR擴增的最適Taq DNA聚合酶濃度

Taq DNA聚合酶是PCR反應(yīng)中的重要因素，用量過多會引起非特異性擴增，過少又使產(chǎn)物量減少。本實驗選擇0.5、0.75、1.00、1.25、1.50 U 5個濃度。從圖5可看出，隨著Taq DNA聚合酶量的增加，PCR擴增條帶亮度呈上升的趨勢，但當(dāng)Taq DNA聚合酶用量達到1.00 U后，擴增條帶亮度上升不明顯，從節(jié)約的角度出發(fā)，選擇1.00 U為本次實驗中的使用濃度。

2.6 SSR引物的篩選

由上述SSR-PCR體系優(yōu)化實驗，確定最適PCR體系，即10×PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.25 μL、MgCl2（25mmol/L）2.5 μL、Primer F（10 μmol/L）1 μL、Primer R（10 μmol/L）1 μL、Taq（5 U/μL）0.25 μL、DNA 1 μL、ddH2O 16.5 μL。由這一PCR反應(yīng)體系，以900和294植株的DNA為模板，從100對SSR引物中篩選到具有擴增產(chǎn)物的引物19對，再通過梯度PCR確定每對引物的最佳退火溫度，篩選結(jié)果見表1。

2.7 澳洲堅果雜交F1代的鑒定

確定退火溫度后，再一次用900（母本）、294（父本）及其雜交子代F1為DNA模板進行PCR擴增，其PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以硝酸銀染色，結(jié)果顯示只有引物15和引物17在此組合中存在特異性條帶（圖6）。從圖6可看出，兩對引物所得結(jié)果具有同一性，因此SSR標(biāo)記可以作為澳洲堅果雜交子代鑒定的方法。

3 討論

雖然SSR標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物的輔助育種，但其原理是基于PCR，會受到模板DNA質(zhì)量、dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度以及引物濃度等因素的影響。在本實驗中，當(dāng)各個因素水平較低或較高時，PCR擴增效果都不好，因此對SSR體系的優(yōu)化很有必要。

傳統(tǒng)的澳洲堅果資源鑒定方法是形態(tài)性和農(nóng)藝學(xué)性狀，即進行性狀調(diào)查，通過株型、葉型、果型、花色、果色等表型性狀對其進行鑒定，費時費力且易受環(huán)境因素的干擾，其他作物上研究表明，分子標(biāo)記是行之有效的遺傳多樣性的鑒定方法。本實驗利用SSR標(biāo)記技術(shù)成功進行了澳洲堅果雜交F1代的鑒定，說明SSR標(biāo)記技術(shù)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鑒定，克服田間調(diào)查周期長、易受環(huán)境干擾等問題。此外本實驗從100對SSR 引物中僅篩選出2對有效的引物，其利用率低。SSR引物的開發(fā)主要決定于遺傳基因的多態(tài)性，但澳洲堅果的不同品種間由于親緣關(guān)系較近，SSR表現(xiàn)出來的多態(tài)性都較差，因此澳洲堅果SSR 引物開發(fā)難度比較大。但是隨著DNA測序技術(shù)的發(fā)展，更多SSR位點被發(fā)現(xiàn)，開發(fā)引物的難度將會大大降低，相信在將來SSR標(biāo)記技術(shù)將會廣泛應(yīng)用于澳洲堅果子代鑒定上，成為育種工作的重要輔助方法。

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