任俊英 李銀鳳 王維琴 皇甫昱

[摘要] 目的 通過檢測HE4在卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤、異位子宮內膜、正常內膜中的表達，把HE4作為一個腫瘤標記物，來鑒別盆腔腫物性質提供診斷依據。 方法 整群選取內蒙古人民醫(yī)院2012年7月—2014年7月收治的167例手術患者，通過病理確診：其中子宮內膜異位癥的60例，卵巢良性腫瘤組織標本30例，正常內膜組織的因子宮病變而進行子宮全切術的患者30例，上皮性卵巢癌47例。采用免疫組化實驗方法對各組石蠟切片進行化學染色，并進行對各組標本染色結果的染色強度進行評價，同時應用mIgae-or-plus對染色切片中的陽性部分測量其平均灰度值（meanIOD），并分析HE4在各組中的表達情況。結果 子宮內膜異位癥、卵巢上皮性惡性腫瘤、正常內膜中均有HE4的表達，HE4在卵巢良性腫瘤中的表達呈弱陽性或者陰性表達。HE4的表達在卵巢上皮性惡性腫瘤、子宮異位內膜、正常內膜、卵巢良性腫瘤中表達呈逐級下降趨勢，HE4在四種不同組織中的表達的mean IOD值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而且進行兩兩組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 ①HE4在卵巢上皮性惡性腫瘤、子宮內膜異位癥、正常內膜、卵巢良性腫瘤中的表達呈現(xiàn)逐級下降趨勢，通過探索性研究，HE4可能作為一個良好的卵巢腫瘤標記物，有助于來鑒別盆腔腫物性質提供診斷依據；也表明HE4對腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移、預后等發(fā)揮著重要作用。

[關鍵詞] HE4；卵巢腫瘤；子宮內膜異位癥；免疫組化

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）03（b）-0015-04

[Abstract] Objective To detect the expression of HE4， a tumor marker， in patients with malignant epithelial ovarian cancer， benign ovarian tumor， endometriosis and normal endometrium so as to provide a diagnostic base for the identification of pelvic tumor. Methods In this study， 167 tissue specimens are from the Department of Pathology， Inner Mongolia Peoples Hospital， from July 2012 to July 2014. Totally 60 endometriosis samples were investigated as the experimental group， the benign ovarian tumor tissue samples from 30 cases and normal endometrium tissue samples from 30 cases underwent hysterectomy due to uterine lesions were set as the negative control respectively， and 47 samples of epithelial ovarian cancer as the positive control group. The expression of HE4 was examined by immunohistochemical staining between experimental group and control group. The expression intensity of HE4 was estimated by the microscope. The mean IOD of positive expression rates of HE4 were determined by mIgae-or-plus. The expression of HE4 in the groups was analyzed. Results Endometriosis， malignant epithelial ovarian tumor and normal endometrium had the distinct expression of HE4. The expression of HE4 was weakly positive or negative in benign ovarian tumor. The expression of HE4 showed a step-down trend in the malignant epithelial ovarian tumor， endometriosis， normal endometrium and benign ovarian tumor， and the mean IOD value of HE4 expression in the four different tissues had significant difference （P<0.05）， and pairwise comparisons were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression of HE4 showed a step-down trend in the malignant epithelial ovarian tumor， endometriosis， normal endometrium and benign ovarian tumor. The study indicated that HE4 may be a good epithelial ovarian tumor marker， which provides diagnostic basis for identifying the nature of pelvic tumor； and plays an important role in the oncogenesis， invasion， metastasis， and outcome of the tumor.

[Key words卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首，5年生存率有早期的80%下降為晚期的15%[1]。目前，對于早期診斷卵巢癌其敏感性和準確性均欠佳。因此對2012年7月—2014年7月就診于內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院患者，根據術后病理確診為卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤、異位子宮內膜、正常內膜進行免疫組化檢測HE4的表達結果，有望把HE4作為一個腫瘤標記物[2]，來鑒別盆腔腫物性質提供診斷依據，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群選擇內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院2012年7月—2014年7月收治的手術病例167例，通過病理確診的卵巢腫瘤手術患者石蠟標本，其中上皮性卵巢癌47例年齡35～82歲，平均年齡45.5歲，卵巢良性腫瘤組織標本30例年齡16～67歲，平均年齡34.4歲，子宮內膜異位癥的60例年齡31～52歲，平均年齡35歲，正常內膜組織的因子宮病變而進行子宮全切術的患者30例年齡41～56歲，平均年齡49歲。實驗組：異位內膜組織蠟塊60例。陰性對照組：卵巢良性腫瘤組織標本30例正常對照組：正常內膜組織標本30例；陽性對照組：卵巢上皮性惡性腫瘤組織標本47例。4組樣本之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 試劑及方法

一抗：即用型兔抗人HE4多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，規(guī)格100 ug濃縮液。批號14406-1AP；保存開封后4℃保存。二抗：即用型SABC免疫組化染色試劑盒，規(guī)格：12 mL 4℃保存，避免冷凍，DAB試劑盒：以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 試驗方法

免疫組化染色：標本石蠟塊，制作成4 μm石蠟切片，烤片，脫蠟，水化，滴加3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）熱修復抗原，5%BSA封閉液滴加于每張切片，每張切片滴加第一抗體兔抗人多克隆抗體HE4，4℃冰箱過夜，PBS液洗片，每張切片加試劑山羊抗兔IgG，20～37℃溫箱下卵育20 min，PBS沖洗，每張切片滴加SABC，室溫下孵育15 min，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，封片，然后在顯微鏡下閱片并照相。

觀察標準：病理科由2名醫(yī)生用雙盲法分別進行閱片監(jiān)測。綜合染色強度和陽性細胞百分率分布按照SHIMIZU等方法確定HE4在組織中的表達水平。①染色強度，染色不清楚（和）或無染色為0分；染色強于陰性顯示為弱黃色為1分；染色清晰棕黃色為2分；染色強為深棕色（和）或褐色為3分。②陽性細胞百分率：陽性細胞數(shù)<10%為0分；11%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。每張切片計分等于以上二項分數(shù)的乘積；0～1分為（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中度陽性（++）；﹥5分為強陽性（+++）。

mIgae-or-plus5.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)下，測量每張切片的陽性細胞的平均灰度值（mean IOD）并將數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計方法

所得數(shù)據均應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理分析。計量資料以（x±s）表示，兩獨立樣本均數(shù)比較用t檢驗；多個樣本均數(shù)比較，經檢驗方差不齊，采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗；計數(shù)資料組間兩兩比較采用行×列資料分割的χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE4在子宮異位內膜、卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤、正常內膜組織中的表達情況

根據測得的平均灰度值分析HE4在四個組間的表達情況：卵巢上皮性惡性腫瘤組織中HE4顆粒定位于組織中的細胞漿里，呈棕褐色腔緣陽性顆粒，其表達的mean IOD值為（0.4982±0.0284）。異位內膜組織中HE4顆粒定位于子宮內膜腺上皮細胞胞膜及細胞漿中呈棕黃色陽性顆粒部分間質可見陽性表達，其表達的mean IOD值為（0.5801±0.0115）。正常內膜組織中HE4顆粒定位于子宮內膜腺上皮細胞胞膜及細胞漿中呈淡黃色弱陽性顆粒，部分間質可見弱陽性表達，其表達的mean IOD值為（0.6801±0.0105）。卵巢良性腫瘤組織中HE4顆粒定位于組織中的細胞漿里，呈淡黃色弱陽性顆?；蜿幮员磉_，其表達的meanIOD值為（0.7582±0.0172）。

將上述4組HE4表達的meanIOD值比較，（F檢驗）差異有統(tǒng)計學意義（F=10.162，P<0.05）（見表1）。4組資料兩兩比較，各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

注：子宮內膜異位癥與卵巢上皮性癌兩組間比較，t=77.894，P=0.000；子宮內膜異位癥與正常內膜兩組間比較，t=59.346，P=0.000；子宮內膜異位癥與卵巢良性腫瘤兩組間比較，t=59.345，P=0.000。

2.2 HE4在4組不同組織中陽性表達的頻數(shù)分布進行比較

HE4在卵巢上皮性惡性腫瘤中表達主要為強陽性過表達，而卵巢異位內膜組織中為陽性表達，正常內膜組織中為弱陽性表達，卵巢良性腫瘤組織多數(shù)為陰性表達。經行×列資料分割的χ2檢驗對4種組織中HE4的頻數(shù)分布比較：卵巢上皮性惡性腫瘤組織中HE4的頻數(shù)分布與其他3組的頻數(shù)分布均差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）：卵巢異位內膜組織HE4的頻數(shù)分布與正常內膜組織、卵巢良性腫瘤組織的頻數(shù)分布差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；正常內膜組織與卵巢良性腫瘤組織的頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.800，P=0.371﹥0.05）。見表2。

注：四組資料兩兩比較，除正常內膜組與卵巢良性腫瘤組相比，χ2=0.800，P=0.371>0.05，無統(tǒng)計學意義，其余各組間比較P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

HE4 屬于抑蛋白酶基因家族，定位于染色體20q12 -13. 1，編碼一種與精子成熟相關的小分子分泌蛋白[3] 。HE4cDNA 最早是由Kirchhoff 等于1991 年從人的附睪上皮細胞中發(fā)現(xiàn)的，進一步的研究發(fā)現(xiàn)其主要分布于包括附睪在內的生殖系統(tǒng)上皮，如輸精管上皮、輸卵管上皮和子宮內膜等組織[4]。研究顯示，HE4 在多種惡性腫瘤，如漿液性卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌、胃癌等組織中高表達。大量研究表明，HE4 在識別卵巢癌的早期階段具有很高的靈敏度和特異度。該實驗研究結果顯示：HE4在卵巢漿液性囊腺癌中的表達與子宮內膜異位癥、正常內膜、卵巢良性腫瘤中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），其中HE4在卵巢漿液性囊腺癌中逞強陽性表達，在子宮內膜異位癥的表達呈中度陽性表達而正常內膜、卵巢良性腫瘤中的表達呈弱陽性或陰性表達。大量研究表明，HE4 在識別卵巢癌的早期階段具有很高的靈敏度和特異度，因此國外許多國家已將HE4 作為卵巢癌早期篩查的最佳指標。 陳穎等[5]發(fā)現(xiàn)HE4 mRNA 表達在卵巢癌發(fā)生中作為早期分子事件發(fā)揮重要作用，通過研究卵巢交界性腫瘤、早期卵巢癌和卵巢癌組中HE4mRNA陽性表達率分別為81.0%、85.4%和88.2%， 發(fā)現(xiàn)HE4 mRNA 表達上調參與了卵巢癌發(fā)生和侵襲。HE4作為一個良好的卵巢腫瘤性標記物，有助于鑒別盆腔腫物性質提供依據，并且可檢測卵巢惡性腫瘤的預后及術后復發(fā)[6-8]這也表明HE4對腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移、預后等發(fā)揮著重要作用。

綜上所述通過對HE4不同檢測值范圍的比較，有望制定一個監(jiān)測標準范圍，以便可以診斷卵巢上皮癌與子宮內膜異位癥，進一步對卵巢上皮性癌、子宮內膜異位癥、盆腔良性包塊的鑒別作為一個重要依據[9]。HE4對于卵巢上皮性惡性腫瘤、子宮內膜異位癥均有很好的輔助診斷價值。但對于疾病的早期診斷，如果還能同時結合超聲及婦科檢查可進一步提高其診斷的特異性和準確性。HE4在子宮內膜異位癥與卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)病可能有相似的病理學基礎，且HE4很可能在該類疾病中的某個環(huán)節(jié)發(fā)揮一定的作用。有待于進一步研究，制定一個醫(yī)學參考值范圍，把HE4作為一個很好的卵巢腫瘤標記物對盆腔腫物的性質做出鑒別診斷[10]。

[參考文獻]

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[3] Galgano MT， Hampton GM， Frierson HF Jr. Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues [J]. Modern Pathology， 2006， 19（6）： 847-853.

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（收稿日期：2015-12-15）] HE4； Ovarian tumor； Endometriosis； Immunohistochemistry