姚琳 張俊威 王博 隋美嬌 王偉

[摘要]通過對轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）和表面活性相關(guān)蛋白A（SPA）給藥前后的表達變化及分布，探討芩百清肺濃縮丸對肺炎支原體（MP）感染大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的修復(fù)作用機制。取60只Wistar大鼠，雌雄各半，體重80～100 g，隨機分為6組，每組10只，分別為空白組，模型組，陽性對照組，芩百清肺濃縮丸高、中、低劑量組，采用滴鼻法造模；給藥10 d后收集大鼠肺泡灌洗液、血清、左肺及右肺組織中葉，采用免疫組化法檢測肺組織中TGFβ及SPA的蛋白表達及分布；實時熒光定量PCR法測定肺組織中TGFβ，SPA mRNA的表達；酶聯(lián)免疫法測定血清及肺泡灌洗液（BALF）中SPA的含量。通過數(shù)據(jù)分析可知，芩百清肺濃縮丸能夠下調(diào)肺組織中TGFβ的表達，增加SPA的表達，其中TGFβ主要分布于肺間質(zhì)，SPA主要分布于AECⅡ及部分肺泡巨噬細胞內(nèi)；同時，能夠降低血清中SPA含量，增加BALF中SPA含量。通過以上結(jié)果可知，芩百清肺濃縮丸通過降低TGFβ的表達抑制AECⅡ發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并增加SPA的表達，恢復(fù)肺的正常形態(tài)與功能；同時，對MP引起的肺組織毛細血管損傷具有一定的修復(fù)作用。

[關(guān)鍵詞]肺炎支原體；芩百清肺濃縮丸；肺泡Ⅱ型上皮細胞；轉(zhuǎn)化生長因子β；表面活性相關(guān)蛋白A

[Abstract]To discuss the repair mechanism of Qinbai Qingfei concentrated pellets to AECⅡ of rats infected by mycoplasma through the observation of the changes and distribution of TGFβ and SPA in lungs， totally 60 Wistar rats that weighing 80100 g were collected， with male and female in half The rats were divided into six groups randomly， with 10 rats each group， namely blank group， model group， positive group and Qinbai Qingfei concentrated pellets high， middle and low dose groups Rats were infected through nasal intubation drip of MP After 10 days of administration， serum and bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were collected to detect the concentration of surface activity related protein A （SPA） by ELISA， left pulmonary tissues of rats were collected to observe the expression and distribution of transforming growth factorbeta （TGFβ） and SPA by immunohistochemistry， and right pulmonary tissues were taken to detect TGFβ and SPA mRNA expression level by realtime quantitative PCR （RTPCR） Qinbai Qingfei concentrated pellets can reduce the expression of TGFβ and increase the expression of SPA in the lung tissues of rats infected by mycoplasma Specifically， TGFβ was mainly distributed among the lung interstitium， while SPAs were mainly distributed in AECII and parts of alveolar macrophage The level of SPA was reduced in serum and increased in BALF in rats in Qinbai Qingfei concentrated pellets groups It was proved that Qinbai Qingfei concentrated pellets can restore the normal morphology and function of the lung by reducing the content of TGFβ to inhibit epithelialmesenchymal transition （EMT） of alveolar type II epithelial cells and increasing the expression of SPA Qinbai Qingfei concentrated pellets have the repairing ability to capillary vessel damage caused by MP in lung tissues of rats

[Key words]Mycoplasma Pneumoniae； Qinbai Qingfei concentrated pellets； AECⅡ； TGFβ； SPA

doi：10.4268/cjcmm20160821

肺炎支原體（Mycoplasma pneumonia，MP）是引起呼吸道感染常見的病原體，目前臨床上對于肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）的治療主要應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，但是該類抗生素不良反應(yīng)大、副作用強，在殺滅支原體的同時對患者的機體造成一定的損傷，且耐藥率呈逐年上升的趨勢[1]。因此，開發(fā)一種既可以殺滅支原體又可以促進受損肺組織修復(fù)的藥物顯得尤為重要。

芩百清肺濃縮丸（以下簡稱“芩百”）是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院自主研發(fā)，經(jīng)國家審批的第一個用于臨床研究治療小兒支原體肺炎的中藥新藥，由黃芩、百部、地龍、桔梗、麥冬、紫菀6味中藥組成，實驗研究和臨床觀察證明其有較好的抗MP，止咳及修復(fù)受損肺組織等功效[25]。

肺泡Ⅱ型上皮細胞（type Ⅱ alveolar epithelial cell，AECⅡ）是肺泡上皮的干細胞，是合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)及其相關(guān)蛋白的主要細胞[6]。MP感染宿主后，引起的主要病理表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，導(dǎo)致AECⅡ受損，病情嚴重者或反復(fù)發(fā)作可引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT），即上皮細胞失去上皮屬性。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）是一種由多種細胞分泌的具有多重生物學(xué)效應(yīng)的多肽類細胞因子，研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ在AECⅡ發(fā)生EMT過程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[78]。AECⅡ損傷后[910]，可誘導(dǎo)上皮通透性增加，降低肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A （surfactantassociated protein A，SPA）的合成和分泌，SPA含量的降低使肺組織失去保護屏障則導(dǎo)致其損傷進一步加重。

本研究通過比較給藥前后，肺炎支原體感染大鼠肺組織中TGFβ和SPA表達的變化，闡明芩百對AECⅡ的修復(fù)作用，從而為其促進肺組織修復(fù)、恢復(fù)肺功能的作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1材料

芩百清肺濃縮丸（哈爾濱天合力制藥有限公司，批號130701），本品為棕褐色的薄膜包衣濃縮水丸，經(jīng)檢查符合2010年版《中國藥典》丸劑下的各項規(guī)定。

肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株（ATCCFH15531，美國菌種保藏中心）；PPLO培養(yǎng)基（Becton，Dickinson and Company，USA）；TRIzol試劑（美國Invitrogen，批號66211）；Transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司，批號1485422）；Fast Start Universal SYBR Green Master （ROX）（Roche 公司，批號10277200）；SPA，TGFβ，βactin引物（哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司）；TGFβ多克隆抗體（ABCAM公司）；SPA多克隆抗體（SANTA公司）；SPA檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗法，SEA890Ra 96T，L140724594，Uscn）；濃縮型DAB試劑盒（中杉金橋）；二步法免疫組化試劑盒（中杉金橋）。

Wistar大鼠，60只，雌雄各半，體重80～100 g，長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司提供，SPF級，許可證號SCXK（吉）20110004。

SorvaⅡ ST16低溫離心機（Thermo公司）；KDTS3A自動組織脫水機（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；KDBM生物組織包埋機（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；RM2235組織切片機（德國萊卡）；BX41生物顯微鏡（OLYMPUS公司）；DP72 組織生物信號采集分析系統(tǒng)（OLYMPUS公司）；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀（Tecan公司）；9600定量PCR檢測儀（杭州博日）。

2方法

21動物分組、造模及給藥60只Wistar大鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，分別為空白對照組，模型對照組，陽性對照藥組，芩百高、中、低劑量組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，除空白對照組外，其余各組大鼠鼻孔內(nèi)緩緩滴入1×106 CCU·mL-1 MP菌液50 μL，利用其自然吸氣式動作將菌液吸入氣道至肺部，空白對照組滴入等量MP培養(yǎng)液。感染后第2天開始灌胃給藥，每日1次，空白對照組和模型對照組灌胃等容積生理鹽水；陽性對照組灌胃阿奇霉素（首次給藥量為45 mg·kg-1·d-1，第2～5天為225 mg·kg-1·d-1），連續(xù)給藥5 d；芩百高（32 g·kg-1·d-1）、中（16 g·kg-1·d-1）、低（08 g·kg-1·d-1）劑量組連續(xù)給藥10 d。1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，分離血清-80 ℃凍存，用于檢驗血清中SPA含量；收集肺泡灌洗液-80 ℃凍存?zhèn)溆?，用于檢驗肺泡灌洗液（BALF）中SPA含量；剪取左肺組織4%甲醛固定，用于免疫組化檢測；剪取右肺組織中葉，用于提取RNA。

22大鼠肺組織TGFβ，SPA蛋白檢測取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯中透明2次，放入石蠟內(nèi)進行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機上切片，將完全展開的蠟片貼附于清潔載玻片上，68 ℃恒溫箱內(nèi)烤片2 h，采用二步法免疫組化檢測，用顯微鏡觀察組織染色情況。

23大鼠肺組織TGFβ，SPA mRNA檢測以實時熒光定量PCR法檢測TGFβ和SPA mRNA的表達。提取RNA，用酶標(biāo)儀對RNA 純度及濃度進行測定，根據(jù) RNA 濃度調(diào)整總 RNA 的體積，使各樣品逆轉(zhuǎn)錄體系所含的 RNA 量相同，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進行聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列[1113]：TGFβ上游5′GGCGGTGCTCGCTTTGTA3′，下游5′GCCACTCAGGCGTATCAG3′；SPA上游5′TAAGTGCTGCCCTCTGACCT3′，下游5′AGGAGCCATACATGCCAAAC3′；βactin上游5′CGTTGACATCCGTAAAGAC3′，下游5′TGGAAGGTGGACAGTGAG3′。

24大鼠血清及BALF中SPA的測定采用ELISA法檢測，根據(jù)預(yù)實驗，血清和BALF樣品分別稀釋100倍、1 000倍后測定，操作程序按照ELISA試劑盒要求進行。

25統(tǒng)計分析采用 SPSS 180 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，以P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

31大鼠肺組織TGFβ，SPA蛋白表達的免疫組化檢測顯微鏡下觀察，放大200倍，每組每張片子選3個視野，分別測每個褐色斑點的MOD，求和并取平均值，用IPP軟件分析，顏色越深，表達越強。

通過對TGFβ蛋白表達檢測可知，空白對照組大鼠肺組織中在肺間質(zhì)及肺泡壁周圍可見少量的TGFβ蛋白表達，在肺泡漿內(nèi)可見弱的黃色顆粒，且著色較淺；與空白組比較，模型組大鼠肺間質(zhì)及肺泡壁周圍的TGFβ蛋白表達明顯，可見大量棕黃色顆粒，病灶內(nèi)血管、支氣管周圍滲出的部分炎癥細胞、肺泡間隔中的間質(zhì)細胞均有深黃色顆粒，胞漿內(nèi)棕黃色顆粒著色較深，分布密集，個別可見團塊狀分布，具有顯著性差異（P<001）；與模型組比較，芩百各劑量組TGFβ蛋白表達明顯下降（P<005），且高劑量組下降明顯（表1，圖1）。

通過對SPA蛋白表達檢測可知，空白對照組可見SPA表達豐富，密集而深，分布于AECⅡ及部分肺泡巨噬細胞內(nèi)，呈棕黃至棕褐色顆粒，肺泡及細支氣管腔內(nèi)可見一層深棕色物質(zhì)；與空白對照組比較，模型對照組SPA表達則較分散，著色較淺，呈棕褐色顆粒，具有顯著性差異（P<001）；與模型組比較，芩百高、中劑量組SPA表達提高（P<005），可明顯觀察到AECⅡ內(nèi)棕黃色顆粒數(shù)量和顏色增多、變深（表1，圖2）。

32大鼠肺組織TGFβ，SPA mRNA表達與模型組比較，芩百各劑量組TGFβ基因表達明顯下降（P<005），且高劑量組下降明顯；而SPA基因表達明顯增加（P<005），同樣高劑量組表達更加明顯（表2）。33大鼠血清及BALF中SPA的含量測定與空白對照組比較，模型組血清中SPA含量明顯上調(diào)（P<001），而BALF中SPA含量下調(diào)（P<005）；與模型組相比，陽性對照組血清中SPA含量變化不顯著，BALF中SPA含量略有上調(diào)，但均無統(tǒng)計學(xué)意義，芩百高、中、低各組血清中SPA含量下調(diào)（P<005），BALF中SPA含量增加（P<005）（表3）。

4討論

TGFβ為胞漿型表達的細胞因子，其陽性表達

產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀分布于胞漿中，各組大鼠肺組織中TGFβ表達主要分布于肺間質(zhì)，也見于肺泡壁，陽性表達顆粒主要位于胞質(zhì)內(nèi)，顏色越深表達越強。通過模型組與空白對照組對比可以看出，MP感染大鼠后，由于外界的刺激導(dǎo)致TGFβ的分泌量增多，促使上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變，而各給藥組TGFβ的蛋白表達降低，說明藥物能夠通過降低TGFβ的蛋白表達減輕炎癥反應(yīng)，抑制上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變過程。

SPA主要分布于AECⅡ及部分肺泡巨噬細胞內(nèi)，免疫組化染色后呈棕褐色顆粒，空白對照組SPA分布密集，且著色較深；而與空白對照組比較，模型對照組SPA表達則較分散，著色較淺，說明MP感染大鼠后，SPA的蛋白表達降低，提示AECⅡ受損，肺組織失去保護屏障，其正常生理功能受到影響。與模型對照組比較，各給藥組能夠提高SPA的蛋白表達量，說明藥物對受損的AECⅡ具有修復(fù)的作用，促進其分泌和合成SPA，恢復(fù)肺的正常生理功能，使其進入良性的生理狀態(tài)。

MPP大鼠肺組織中TGFβ及SPA mRNA的檢測結(jié)果表明，大鼠感染MP后肺組織中TGFβ mRNA顯著上調(diào)，而SPA mRNA表達下降，提示MP感染在引起間質(zhì)性肺炎的過程中可增加肺組織中TGFβ的分泌，提高TGFβ mRNA表達，促進AECⅡ的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；AECⅡ發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后，SPA分泌減少，SPA mRNA表達下降，加重了肺組織的炎癥反應(yīng)程度。與模型對照組比較，各給藥組肺組織TGFβ mRNA表達顯著下調(diào)，同時SPA mRNA表達顯著提高，并顯現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，提示芩百能夠減少肺組織中TGFβ的分泌，降低TGFβ mRNA表達，抑制AECⅡ的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，恢復(fù)AECⅡ的正常形態(tài)和功能；AECⅡ功能得以恢復(fù)的同時，促進SPA的合成和分泌，SPA mRNA表達上調(diào)，則進一步維護肺組織的正常形態(tài)和生理功能。

SPA可用來評價肺氣血屏障的完整性，也可作為MP感染肺組織后AECⅡ功能的早期指標(biāo)。SPA的合成和分泌具有一定的肺特異性，主要由AECⅡ表達。正常情況下，SPA在血液中是不表達或表達很微量的，但當(dāng)宿主被感染時，肺泡上皮細胞和周圍毛細血管受到炎性細胞的浸潤而造成不同程度的損傷，肺泡毛細血管通透性增加，SPA從肺泡腔滲漏到通透性增強的肺泡毛細血管中并隨血流入血[14]，導(dǎo)致在體循環(huán)血液中SPA水平上升，因此可根據(jù)血清中SPA的水平來反應(yīng)肺損傷的嚴重程度。

MPP大鼠肺泡灌洗液和血清中SPA的含量檢測結(jié)果表明，大鼠感染MP后其BALF中SPA含量明顯下降而血清中SPA含量明顯增高，提示MP感染后AECⅡ及毛細血管受損。與模型組比較，各給藥組均能增加BALF中SPA含量，同時降低血清中SPA含量。提示芩百能夠保護AECⅡ合成和分泌SPA的功能，并減輕MP感染引起的炎癥反應(yīng)及毛細血管損傷，維持肺組織的正常形態(tài)和功能。而陽性對照組與模型組比較，BALF和血清中SPA含量均無顯著差異，說明阿奇霉素雖然具有良好的抗MP作用，但對MP感染和炎性細胞浸潤引起的毛細血管損傷的修復(fù)作用不明顯。

本研究結(jié)果表明，芩百清肺濃縮丸通過降低TGFβ表達，抑制AECⅡ發(fā)生EMT，促進AECⅡ合成和分泌SPA，并對炎性細胞浸潤引起的毛細血管損傷具有較好的修復(fù)作用，阻止SPA進入體循環(huán)，增加肺組織中SPA的含量，從而對肺組織起到保護和修復(fù)的作用，恢復(fù)其正常形態(tài)和生理功能。

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[責(zé)任編輯馬超一]