黃約諾 黃立搜 徐鵬 陳素珍 樓黎明

[摘要] 目的 探討參附注射液對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用。 方法 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP） 建立大鼠膿毒癥模型。健康成年雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為三組，每組24只：假手術(shù)組、膿毒癥組、參附干預(yù)組。動物模型制備成功后，各組在腹腔注入?yún)⒏阶⑸湟海?0 mL/kg）或等量生理鹽水后，于術(shù)后3 h、12 h和24 h檢測肺組織勻漿標(biāo)本超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、黃嘌呤氧化酶（XO）活力和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果 與膿毒癥組比較，參附干預(yù)組大鼠肺組織SOD、GSH-Px活性顯著升高（P<0.01），而XO、MDA水平顯著降低（P<0.01）。 結(jié)論 參附注射液可通過減少肺氧自由基的產(chǎn)生，減輕肺損傷。

[關(guān)鍵詞] 參附注射液；膿毒癥；肺損傷；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；黃嘌呤氧化酶；丙二醛

[中圖分類號] R459.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）06-0026-03

Protective effects of Shenfu injection on lung injury in rats with sepsis

HUANG Yuenuo HUANG Lisou XU Peng CHEN Suzhen LOU Liming

Department of Respiratory Diseases， the Third Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of Shenfu injection on pulmonary injury induced by sepsis in rats. Methods Cecal ligation and puncture（CLP） model was used to generate sepsis in rats. SD 72 male rats were randomly divided into three groups with 24 cases in each group： sham operation group， sepsis group， Shenfu intervention group. After generating the animal model groups successfully， injecting Shenfu injection（10 mL/kg） or normal saline in the abdominal cavity， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， xanthine oxidase （XO） activity， malondialdehyde（MDA） contents in lung tissue homogenate were observed 3 hours， 12 hours and 24 hours after CLP. Results Compared with the sepsis group， rats lung tissue SOD， GSH-PX activity of Shenfu intervention group significantly increased（P<0.01）， and XO and MDA levels significantly reduced（P<0.01）. Conclusion Shenfu injection can reduce the pulmonary injury by decreasing the production of oxygen free radicals.

[Key words] Shenfu injection； Sepsis； Pulmonary injury； Superoxide dismutase（SOD）； Glutathione peroxidase（GSH-Px）； Xanthine oxidase（XO）； Malondialdehyde（MDA）

膿毒癥是臨床上常見的急危重癥之一，除可引起劇烈的全身炎癥反應(yīng)外，還可導(dǎo)致多臟器功能不全。在眾多膿毒癥并發(fā)的器官損傷中，膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）發(fā)生早、病情重，是加速患者死亡的重要原因之一[1]。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）模型是目前公認(rèn)的膿毒癥模型[2]，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。參附注射液在臨床上廣泛應(yīng)用于危重患者的救治，本研究采用CLP制備大鼠膿毒癥模型，觀察參附注射液對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

健康成年雄性SD大鼠72只，體重量280～350 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物與試劑

參附注射液（規(guī)格：50 mL/瓶，批號：15130064175，雅安三九藥業(yè)有限公司）；黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）試劑盒：生產(chǎn)公司：美國RND公司，批號：R3201L。丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：生產(chǎn)公司：美國RND公司，批號：R4785L。超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）試劑盒：生產(chǎn)公司：美國RND公司，批號：R4421L。谷胱甘肽過氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒：生產(chǎn)公司：美國RND公司，批號：R7098L。

1.3 分組及模型制備

健康成年雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為三組，每組24只：假手術(shù)組、膿毒癥組、參附干預(yù)組。采用胡丹丹等[3]建立的CLP法制備大鼠膿毒癥模型，動物模型制備成功后，各組在腹腔注入?yún)⒏阶⑸湟海?0 mL/kg）或等量生理鹽水。

1.4 標(biāo)本采集

術(shù)后3 h、12 h和24 h各組分別取8只大鼠，給予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動脈采血處死。處死大鼠后，留取左肺固定于4%甲醛中準(zhǔn)備石蠟包埋切片行HE染色，留取右肺置于-70℃冰箱，用于制作肺組織勻漿。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測肺組織勻漿標(biāo)本黃嘌呤氧化酶（XO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的含量。

1.5 肺組織病理改變

將取出的肺組織、用梯度酒精脫水、浸蠟和包埋，制成石蠟塊，用蘇木素染色，鹽酸酒精分化及自來水返藍(lán)，之后伊紅染色，再次脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行肺組織病理觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理結(jié)果

假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，水腫和炎癥滲出少；隨著時間的推移，與假手術(shù)組比較，模型組肺組織可見炎性細(xì)胞浸潤逐漸加重，肺水腫、出血以及肺不張逐漸加重，肺泡間隔逐漸增厚并破壞；參附干預(yù)組肺組織可見炎性細(xì)胞浸潤逐漸減輕，肺水腫、出血以及肺不張逐漸減輕，肺泡間隔逐漸修復(fù)。見封三圖4。

2.2 各組大鼠肺組織中XO、MDA、SOD、GSH-Px的含量比較

與假手術(shù)組比較，膿毒癥組大鼠肺組織XO、MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px含量顯著降低（P<0.01）；與膿毒癥組比較，參附干預(yù)組大鼠肺組織XO、MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量顯著升高，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

3 討論

膿毒癥是臨床常見的危重癥，是由細(xì)菌感染引起的全身炎癥反應(yīng)（SRIS）最常見的并發(fā)癥，具有高發(fā)病率、高死亡率等特點[4]，導(dǎo)致肺、腎、肝、腸道等多臟器功能障礙，而肺往往是最早、最易受損的靶器官，因此，膿毒癥肺損傷往往是最常見的死亡原因[5]，表現(xiàn)為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征。目前其機(jī)制尚未完全明了，且缺乏針對性的干預(yù)措施，所以研究膿毒癥導(dǎo)致肺損傷機(jī)制及其治療具有重要的意義[6]。

氧化應(yīng)激在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的作用，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。氧化應(yīng)激不但氧化蛋白質(zhì)，改變蛋白質(zhì)活性，導(dǎo)致蛋白酶釋放，使抗氧化劑和抗蛋白酶失活，而且可以直接損傷DNA導(dǎo)致斷裂和點突變；導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生血管活性物質(zhì)和前炎性物質(zhì)，導(dǎo)致肺微血管完整性和肺泡屏障破壞，引起肺表面活性物質(zhì)減少，從而導(dǎo)致急性肺損傷的發(fā)生[7]。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是嘌呤核苷酸的分解代謝酶， 反映缺氧損傷的情況[8]。急性肺損傷時，機(jī)體內(nèi)XO活性增高， 則氧自由基生成增多。丙二醛（malondialdehyde，MDA）反映體內(nèi)氧自由基生成量及活性，間接反映細(xì)胞受損的程度[9]。MDA含量增加表明CLP術(shù)后氧自由基產(chǎn)生增多，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化增多，肺泡細(xì)胞受損[10]。超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）是重要的抗氧化酶，具有保護(hù)肺損傷的作用[11]。胞外SOD 的活性水平與肺損傷的程度呈負(fù)相關(guān)[12，13]，而氧化應(yīng)激產(chǎn)物可降低SOD活性[14]。谷胱甘肽過氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是氧自由基清除酶，是肺組織重要的抗氧化防御因子，保護(hù)機(jī)體免受脂質(zhì)過氧化物的損害[15]，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。

中醫(yī)學(xué)雖然沒有膿毒癥、急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）等病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)：咳嗽咳痰、氣急、進(jìn)行性呼吸困難、氣促喘憋、紫紺等肺氣壅遏的癥狀，將其歸屬于中醫(yī)學(xué)的溫病的范圍，病機(jī)為外感溫?zé)岫拘?，邪侵犯于肺，熱入陽明，邪與腸中積滯相結(jié)，導(dǎo)致熱結(jié)腸燥，氣滯壅結(jié)，上逆則喘，中阻則滿，邪熱迫瘀，瘀與熱互結(jié)，毒邪瘀積，壅滯在肺，致肺失司，失通調(diào)水道功能，而水液內(nèi)停，從而出現(xiàn)肺氣壅遏等癥狀[16，17]。且認(rèn)為其根本病因為正氣不足，邪氣盛實?！端貑栠z篇·刺法論》說：“正氣存內(nèi)，邪不可干”，《素問·評熱病論》說：“邪之所湊，其氣必虛”，從根本上闡述了疾病的發(fā)生及發(fā)展的內(nèi)在因素——“正虛”，同時也為防治膿毒癥及膿毒癥器官損傷提供了理論依據(jù)——“扶正祛邪”[18]。

參附注射液是由中醫(yī)方劑“參附湯”科學(xué)有效分離提取而制成的中成藥注射劑，其組方來源于《濟(jì)生續(xù)方》之參附湯，由人參和炮附子組成。具有回陽救逆，益氣固脫等作用，臨床上主要應(yīng)用于陽氣暴脫之厥脫證，或陽氣虛所致的驚悸、怔忡、喘、咳、胃痛病、泄瀉病、痹證等疾病。方中人參：性味甘溫，具有振奮元氣，益氣固脫，回陽救急的功效，又善于補(bǔ)氣生血，補(bǔ)益肺脾，故有“扶正補(bǔ)虛之第一要藥”之稱，《神農(nóng)本草經(jīng)》 謂其“主補(bǔ)五臟， 安精神……除邪氣”，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參含有多種人參皂苷，具有抗疲勞、抗休克、促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成及增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效。炮附子：性味辛熱，純陽燥烈，補(bǔ)火助陽，可通行十二經(jīng)脈，溫一身之陽氣，上助心陽以通脈，下補(bǔ)腎陽以益火，有“回陽救逆第一藥”之稱，《本草綱目》謂其“治三陰傷寒……中寒中風(fēng)，痰厥氣厥”，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，炮附子含有烏頭類生物堿，具有抗休克、擴(kuò)充血管、增加血流、改善循環(huán)的作用，其對急性炎癥模型有明顯抑制作用[19]。二藥相配伍而使用，人參不僅可以制約附子的毒性，又可增強(qiáng)附子的功效，二者相合發(fā)揮增效減毒之妙[20]。正如晚清名醫(yī)鄭肖巖稱參附湯為“扶危之至寶，救急之靈丹”[21]。

既往研究發(fā)現(xiàn)其具有抗缺血、抗缺氧、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化等作用，反映了參附注射液對膿毒癥時組織氧自由基損傷的保護(hù)作用。我們的研究顯示，CLP能使大鼠體內(nèi)抗氧化功能下降，自由基產(chǎn)生過氧化反應(yīng)增加，膿毒癥大鼠體內(nèi)存在氧化損傷，大量SOD、GSH-Px被自由基滅活；參附注射液各劑量組大鼠肺組織SOD、GSH-Px的生物活性明顯增強(qiáng)。已有研究顯示氧化應(yīng)激在急性肺損傷發(fā)病中起關(guān)鍵作用，抗氧化劑對急性肺損傷有保護(hù)作用[22]。通過藥物從細(xì)胞及分子水平抗氧化應(yīng)激對治療急性肺損傷是有現(xiàn)實意義的。對于急性肺損傷，參附注射液具有一定的保護(hù)膿毒癥肺損傷的作用。其機(jī)制可能是通過加強(qiáng)肺組織的抗氧化酶的活性，減少氧自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化有關(guān)。雖然近年國內(nèi)外眾多學(xué)者對膿毒癥的發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)行大量的研究。但由于膿毒癥發(fā)病機(jī)制過于復(fù)雜，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2015-12-25）