唐男　張虹

【摘要】 目的：探討mTOR/p70S6K信號(hào)通路在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法：采用天津市中心婦產(chǎn)醫(yī)院2011年1-6月手術(shù)標(biāo)本120例，其中正常卵巢組（Ⅰ組）、上皮性良性卵巢腫瘤組（Ⅱ組）、上皮性卵巢癌組（Ⅲ組），每組各40例。免疫組化染色檢測mTOR、p70S6K在上皮性卵巢組織中的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法測mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達(dá)。采用Kaplan-Meier和log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素生存分析，比較mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平（陰性、陽性組）的卵巢癌患者的生存率。結(jié)果：免疫組化染色顯示：mTOR、p70S6K在Ⅰ組卵巢組織中表達(dá)很低，Ⅱ組卵巢組織中表達(dá)次之，而在Ⅲ組卵巢組織中卻高表達(dá)。與Ⅰ組比較，Ⅱ組、Ⅲ組mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達(dá)增加，與Ⅱ組比較，Ⅲ組mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達(dá)增加。非參數(shù)分析顯示，上皮性卵巢癌組織中mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平與手術(shù)病理分期（P=0.039、0.022）和病理分級（P=0.047、0.037）相關(guān)，與患者年齡、病理類型、腹膜轉(zhuǎn)移無關(guān)（P>0.05）。單因素生存分析顯示，mTOR、p70S6K蛋白的表達(dá)陰性與陽性的總生存時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）。結(jié)論：mTOR/p70S6K信號(hào)通路在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中可能起重要作用。

【關(guān)鍵詞】 mTOR； p70S6K； 上皮性卵巢癌

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mTOR/ p70S6K signaling pathways in epithelial ovarian cancer and their significance.Method：120 surgical specimens in Tianjin Center Maternity Hospital from January 2011 to June 2011 were selected，they included the normal ovarian group（group Ⅰ），the epithelial ovarian benign ovarian tumor group（group Ⅱ），epithelial ovarian cancer（group Ⅲ），40 casess in each group.The expression of mTOR，p70S6K in epithelial ovarian tissue was detected by immunohistochemical staining.The expression of mTORmRNA，p70S6KmRNA were detected by Reverse transcription（RT）-PCR method.Using Kaplan Meier and log-rank test of single factor analysis，the mTOR，p70S6K protein expression level（negative and positive group） of ovarian cancer patients survival rate were compared.Result：Immunohistochemical staining showed that mTOR，p70S6K expressed in ovarian tissue of group Ⅰ was very low，the expression of ovarian tissue in group Ⅱ followed by，and it was highly expressed in ovarian tissue of group Ⅲ.The expression of mTORmRNA and p70S6KmRNA in group Ⅱ，Ⅲ were significantly higher than those in the group Ⅰ，and the expression of mTORmRNA and p70S6KmRNA in group Ⅲ were significantly higher than those in the group Ⅱ.Nonparametric analysis showed that the expression level of mTOR，p70S6K in epithelial ovarian cancer were correlated with the surgical pathologic stage（P=0.039，0.022） and pathologic grade（P=0.047，0.037），had nothing to do with patients age，pathological type，peritoneal metastasis.Single factor survival analysis showed that mTOR，p70S6K protein expression of total survival time in negative and positive，the difference was statistically significant（P=0.021）.Conclusion：The higher expressions of mTOR/ p70S6K signaling pathways are related to occurrence，development，metastasis and prognosis of epithelial ovarian cancer.

【Key words】 mTOR； p70S6K； Epithelial ovarian cancer

First-authors address：Tianjin Medical University，Tianjin 300000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.001

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位[1]。但卵巢上皮癌死亡率卻占各類婦科腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅[2]，明確其發(fā)病機(jī)制，可為有效治療卵巢上皮癌提供幫助。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是近年來研究的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其可通過整合能量狀態(tài)，激素、細(xì)胞、氨基酸、細(xì)胞氧化應(yīng)激等信號(hào)，通過影響蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、凋亡、自噬等多個(gè)生物學(xué)過程[3]。p70S6激酶（p70S6K）作為mTOR蛋白的下游底物，被磷酸化的mTOR激活后可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)p70S6KmRNA的翻譯[4]。研究表明，mTOR/p70S6K信號(hào)通路的激活與乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]，但mTOR/p70S6K信號(hào)通路是否在上皮性卵巢癌組織中有表達(dá)，國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。本研究擬探討mTOR/p70S6K信號(hào)通路在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，為卵巢上皮癌的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用天津市中心婦產(chǎn)醫(yī)院2011年1-6月手術(shù)標(biāo)本共120例，其中包括正常卵巢組（Ⅰ組）、上皮性良性卵巢腫瘤組（Ⅱ組）、上皮性卵巢癌組（Ⅲ組），每組各40例。所有病例為初發(fā)，術(shù)前未行任何治療且肝腎功能正常，無合并妊娠或近期妊娠史。上皮性卵巢癌組患者年齡為35～70歲。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO分期2009年標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期26例。腹膜轉(zhuǎn)移27例，無腹膜轉(zhuǎn)移13例。組織學(xué)分級（世界衛(wèi)生組織WHO，2003）：G1級12例，G2級17例，G3級11例。病理類型：漿液性腺癌22例，黏液性腺癌18例。均取卵巢癌原發(fā)灶組織進(jìn)行試驗(yàn)。40例上皮性良性卵巢腫瘤標(biāo)本均為同期在該院手術(shù)獲得。對照組為隨機(jī)選取的同期圍絕經(jīng)期女性因子宮肌瘤接受手術(shù)要求切除雙附件治療獲得的正常卵巢組織標(biāo)本，共40例。標(biāo)本離體5min內(nèi)經(jīng)液氮速凍后置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，所有組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。術(shù)后進(jìn)行隨訪至2015年6月1日。

1.2 試劑 BIOZOL總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司），BIORT逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒（杭州博日科技有限公司），mTOR引物（上游引物批號(hào)02116，下游引物批號(hào)02117）、p70S6K弓I物（上游引物批號(hào)02118、下游引物批號(hào)02119）以及B.actin內(nèi)參引物（上游引物批號(hào)37496、下游引物批號(hào)37495）均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品，焦碳酸二乙脂（DEPC，BBI公司，批號(hào)DB0154）溴化乙錠（EB，TaKaRa公司）瓊脂糖，無水乙醇，DNAMark（DL2000，TaKaRa公司），GeneAmp 5700型PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），凝膠電泳成像系統(tǒng)（Transilluminator公司），紫外分光光度計(jì)（Cary-50）（澳大利亞Varian公司）。

1.3 免疫組化染色檢測mTOR、p70S6K在上皮性卵巢組織中的表達(dá) 參照文獻(xiàn)[6]采用SP法進(jìn)行免疫組化染：每批染色均設(shè)陰性對照。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，具體如下，（1）陽性細(xì)胞所占百分比評分：無陽性細(xì)胞者記0分，≤5%者記1分，>5%～25%者記2分，>25%～50%者記3分，>50%者記4分；（2）染色強(qiáng)度評分：未著色記0分，淡黃色記1分，黃色記2分，棕黃色記3分；兩種評分相加為總分：總分0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分

為中等陽性（++），≥6分為強(qiáng)陽性（+++）。以+～+++為陽性標(biāo)本，計(jì)算陽性表達(dá)率。

1.4 反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法測mTOR、p70S6KmRNA的表達(dá) 按BIOZOL總RNA提取試劑盒說明進(jìn)行提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按BIORT逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增（RT-PCR）試劑盒說明進(jìn)行，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[7]，mTOR上游引物為5-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3，下游引物為5-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3，共537 bp，p70S6K上游引物為5-TACTTCGGGTACTTGGTAA-3，下游引物為5-GATGAAGGGATGCTTTACT-3，共188 bp，內(nèi)參選用β-actin：上游引物為5-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3，下游引物為5-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3，共302 bp，反應(yīng)總體積25 μL.10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPMixture（10 mmol/L）0.5 μL，每管加入mTOR上下游引物或者p70S6K上下游引物各0.5 μL，上下游內(nèi)參各

0.5 μL，Taq mixDNA polymerase0.5 μL，RT產(chǎn)物2.5 μL，

ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃3 rain預(yù)變性：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 90 s，共經(jīng)過35個(gè)循環(huán)反應(yīng)。所得PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳分離，然后用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.5 隨訪 以電話或來院復(fù)查形式對40例卵巢癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪始于卵巢癌確診后，隨訪截止時(shí)間為2015年6月，隨訪時(shí)間為1～50個(gè)月（中位隨訪時(shí)間25個(gè)月）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的計(jì)量資料采用單因素方差分析，重復(fù)測量設(shè)計(jì)的計(jì)量資料采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法、最小顯著差數(shù)法（LSD）檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，對生存率曲線比較采用log-rank法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色檢測mTOR、p70S6K在上皮性卵巢組織中的表達(dá) 從免疫組化染色檢測結(jié)果可以看出，mTOR蛋白定位于胞漿，p70S6K蛋白定位于細(xì)胞核，在Ⅰ組卵巢組織中表達(dá)很低，Ⅱ組卵巢組織中表達(dá)次之，而在Ⅲ組卵巢組織中卻高表達(dá)。Ⅰ組患者卵巢組織中mTOR、p70S6K蛋白的陽性率表達(dá)分別為2.5%、2.5%，Ⅱ組患者卵巢組織中mTOR、p70S6K蛋白的陽性率表達(dá)分別為12.5%、20.0%，Ⅲ組患者卵巢漿液性腺癌組織中mTOR、p70S6K蛋白的陽性率表達(dá)分別為45.5%、59.1%，黏液性腺癌組織中mTOR、p70S6K蛋白的陽性率表達(dá)分別為66.7%、61.1%，詳見圖1～2、表1。

2.2 反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法測mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達(dá) 與Ⅰ組比較，Ⅱ組、Ⅲ組的mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達(dá)增加，與Ⅱ組比較，Ⅲ組mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達(dá)增加，見表2。

2.3 mTOR、p70S6K 蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 非參數(shù)分析顯示，上皮性卵巢癌組織中mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平與手術(shù)病理分期（P=0.039、0.022）和病理分級（P=0.047、0.037）相關(guān)，與患者年齡、病理類型、腹膜轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P>0.05），見表3。

2.4 mTOR、p70S6K蛋白的表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者預(yù)后比較 單因素生存分析顯示，mTOR、p70S6K蛋白的表達(dá)陰性與陽性的總生存時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021），見圖3。

3 討論

目前，卵巢惡性腫瘤死亡率居?jì)D科惡性腫瘤的首位，上皮性卵巢癌約占90%，所以上皮性卵巢癌成為最受關(guān)注的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展非常隱匿，通?；颊邲]有特異性癥狀，僅到病情發(fā)展到一定程度才呈現(xiàn)出腹脹、腹部包塊等癥狀和體征。因此多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，手術(shù)和輔助治療的效果不理想，預(yù)后差，5年生存率低[8]。所以有必要了解卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為尋找遏制腫瘤細(xì)胞的致瘤能力的方法奠定基礎(chǔ)。目前，信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的缺陷和異?；罨c腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系已成為腫瘤分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，同時(shí)通過干預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)途徑治療腫瘤也成為生物治療的新興領(lǐng)域。

mTOR是一種編碼2549個(gè)氨基酸的絲/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約289 kDa，其C末端與PI3K的催化結(jié)構(gòu)域具有高度同源性，故而屬于PI3K蛋白家族成員。由于mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，而細(xì)胞周期進(jìn)程的異常調(diào)節(jié)與癌癥有關(guān)，因此mTOR信號(hào)通路在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中處于核心地位[9]。Murayama等[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中mTOR的表達(dá)與胃腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期明顯正相關(guān)。另有研究報(bào)道，在手術(shù)切除的胰腺導(dǎo)管癌標(biāo)本中，胰腺癌細(xì)胞中mToR被激活，而且，mToR抑制劑對胰腺癌具有潛在的抗癌活性[11]。綜上可見，mTOR在許多惡性腫瘤組織中高表達(dá)，提示mTOR可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

p70S6K作為mTOR下游的主要靶蛋白之一，是mTOR下游底物中目前研究較為廣泛的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有核糖體蛋白激酶的活性，活化后能夠磷酸化激活核糖體40S小亞基S6蛋白，而S6蛋白可提高含5-TOP的mRNA的翻譯效率[12]，當(dāng)其第389位蘇氨酸殘基（Thr389）被磷酸化后，活性上升，促進(jìn)核糖體及其他調(diào)節(jié)蛋白的合成，介導(dǎo)細(xì)胞生長和增殖[13]，同時(shí)，mTOR的主要生物學(xué)功能也是通過p70S6K來實(shí)現(xiàn)的。因此本研究觀察mTOR和p70S6K蛋白表達(dá)。

本研究通過免疫組化染色檢測發(fā)現(xiàn)mTOR、p70S6K在正常上皮性卵巢組織中表達(dá)很低，而在上皮性卵巢癌組織中卻高表達(dá)；mTOR、p70S6KmRNA的表達(dá)增加并且與病理分級相關(guān)，其機(jī)制可能是上皮性卵巢癌中LKB1激活[14]，使其下游mTOR激活，mTOR是大多數(shù)細(xì)胞分裂增殖信號(hào)傳導(dǎo)的中樞可以抑制多種刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖。mToR信號(hào)通路不僅對正常細(xì)胞生長增殖起著重要作用，而且與正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及癌細(xì)胞的生長、增殖密切相關(guān)，同時(shí)參與血管形成，在腫瘤的形成中扮演重要角色，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。mTOR激活后，使其下游p70S6K激活，促進(jìn)p70S6KmRNA翻譯活性增強(qiáng)，協(xié)同刺激癌細(xì)胞蛋白質(zhì)及核糖體合成，從而控制細(xì)胞從G1期到S期，促進(jìn)癌細(xì)胞生長及增殖[16]。

綜上所述，mTOR/p70S6K信號(hào)通路在上皮性卵巢癌組織中的高表達(dá)，提示mTOR和p70S6K蛋白可能是一種新的癌基因，其對卵巢癌患者的預(yù)后可能有預(yù)測價(jià)值。該信號(hào)通路將可能成為認(rèn)知和探索上皮性卵巢癌形成機(jī)制新的研究方向，以此為靶向的早期干預(yù)治療有待進(jìn)一步的深入研究。

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（收稿日期：2015-07-27） （本文編輯：歐麗）