侯艷杰 房宏霞 蔚鳴 閆朋 許雪薇 許鑫鑫 張寶慶 劉春濤 劉玉琴

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實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)在繼發(fā)性肺結(jié)核患者中的應(yīng)用價值

侯艷杰 房宏霞 蔚鳴 閆朋 許雪薇 許鑫鑫 張寶慶 劉春濤 劉玉琴

目的 評價實時熒光核酸恒溫擴增檢測 (simultaneous amplification and testing,SAT) 技術(shù)在繼發(fā)性肺結(jié)核患者中的臨床應(yīng)用價值。方法 收集2014年1月至2015年9月在黑龍江省傳染病防治院結(jié)核內(nèi)科住院的1036例臨床診斷為繼發(fā)性肺結(jié)核患者的晨痰樣本，同時使用痰抗酸桿菌顯微鏡檢查、分枝桿菌液體培養(yǎng)及SAT法3種技術(shù)進行檢測。采用χ2檢驗比較各方法間的陽性檢出率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；用Kappa檢驗比較SAT與其他檢測技術(shù)間的一致性。結(jié)果 SAT、痰涂片、液體培養(yǎng)3種檢測方法的陽性檢出率分別為55.02%(570/1036)，47.30%(490/1036)和50.39%(522/1036),SAT法陽性檢出率較涂片、液體培養(yǎng)分別高7.72%(80/1036)、4.63%(48/1036)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為32.505、13.470,P值均<0.05)。SAT與涂片、培養(yǎng)方法比較K值分別為0.63、0.68。結(jié)論 SAT法較痰涂片和液體培養(yǎng)的陽性檢出率高，與痰涂片和液體培養(yǎng)比較具有較高一致性，有助于快速篩查及診治繼發(fā)性肺結(jié)核。

結(jié)核, 肺/繼發(fā)性； 核酸擴增技術(shù)； 核酸探針； 實驗室技術(shù)和方法； 對比研究

結(jié)核病的傳染源主要是痰涂片陽性患者，傳染性的大小取決于痰內(nèi)菌量的多少。直接涂片法查出結(jié)核分枝桿菌者屬于大量排菌，直接涂片法檢查陰性而僅培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌者屬于微量排菌[1]。目前，我國菌陰肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的60%～70%[2]，具有潛在的傳染風(fēng)險，應(yīng)用敏感度、特異度、準(zhǔn)確度較高的檢測方法，能提高其陽性檢出率，在快速診治及發(fā)現(xiàn)傳染源方面起到輔助作用。

結(jié)核病的診斷方法目前主要包括痰涂片鏡檢、培養(yǎng)法、免疫學(xué)、分子診斷技術(shù)[3-4]。傳統(tǒng)的結(jié)核病實驗室診斷方法中，涂片顯微鏡檢查敏感度較低，雖然固體培養(yǎng)具有較高的敏感度，但是獲得實驗結(jié)果至少需要3～8周，耗時較長。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來涌現(xiàn)出許多可用于MTB快速診斷及鑒定的方法[5]。在國外已將轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)(transcription mediated amplification，TMA)作為結(jié)核病臨床診斷的常規(guī)檢查方法。實時熒光核酸恒溫擴增檢測 (simultaneous amplification and testing,SAT) 技術(shù)是TMA的同類技術(shù)，已有研究人員將其應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的檢測[6-7]，但其檢測效果尚無定論，有必要對其在臨床應(yīng)用中做進一步的研究與驗證。本研究對同一患者標(biāo)本采用痰抗酸桿菌顯微鏡檢查、分枝桿菌液體培養(yǎng)及SAT法3種技術(shù)同時進行檢測，分別以痰涂片和液體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，評價SAT技術(shù)在繼發(fā)性肺結(jié)核快速診斷中的臨床應(yīng)用價值。

資料和方法

一、患者來源

本研究為對黑龍江省傳染病防治院臨床檢查實驗室現(xiàn)有檢查結(jié)果的回顧性分析。以2014年1月至2015年9月在黑龍江省傳染病防治院結(jié)核內(nèi)科住院且依據(jù)《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)》[8]確診、依據(jù)《2004年中華人民共和國結(jié)核病分類標(biāo)準(zhǔn)》[9]分類的繼發(fā)性肺結(jié)核患者的晨痰樣本為研究對象。對收集到的晨痰樣本同時采用痰抗酸桿菌顯微鏡檢查、分枝桿菌液體培養(yǎng)及SAT法3種技術(shù)進行檢測。研究期間結(jié)核內(nèi)科共確診繼發(fā)性肺結(jié)核患者1036例，其中男668例(64.48%)，女368例(35.52%)，年齡為10～85歲，年齡中位數(shù)為42(36，52)歲。所有患者均采集到合格痰樣本并納入研究。因本研究對象為去患者標(biāo)識的痰樣本，不涉及倫理學(xué)要求范疇。

二、主要試劑與儀器

痰抗酸桿菌顯微鏡檢查采用熒光染色顯微鏡檢查法，金胺“O”染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；分枝桿菌液體培養(yǎng)采用BACTECTMMGITTM960操作系統(tǒng)，由美國BD公司提供；SAT技術(shù)采用結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴增)，由上海仁度生物科技有限公司提供；全自動實時熒光定量核酸擴增儀(Mx3005P)為美國安捷倫科技公司生產(chǎn)。

三、方法

(一)痰抗酸桿菌顯微鏡檢查、分枝桿菌液體培養(yǎng)

遵照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[10]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行，并且該兩項檢測方法室間質(zhì)量評價和室內(nèi)質(zhì)量控制合格。

(二) SAT技術(shù)方法

1.SAT技術(shù)原理： SAT使用莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV-RT)、T7 RNA多聚酶和優(yōu)化探針技術(shù)來同時實現(xiàn)。反轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個DNA拷貝，T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個RNA拷貝，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，該熒光信號可由檢測儀器捕獲。

2.SAT檢測方法：嚴(yán)格按照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)操作程序操作。取1.5 ml痰液加入至1～2倍體積的NaOH(4%)，充分液化后，離心用TB稀釋液重懸，與陽性對照、陰性對照、臨界弱陽性對照分別取50 μl 進行超聲處理。取2 μl處理物加入30 μl擴增檢測液(按照30 μl反應(yīng)液和2 μl檢測液配制)，60 ℃ 10 min，42 ℃ 5 min，隨后加入10 μl SAT酶液，轉(zhuǎn)置熒光檢測儀，進行42 ℃恒溫擴增檢測操作。結(jié)果判定檢測時間(detection time， dt)值≤35 min為陽性

四、統(tǒng)計學(xué)分析

記錄每例患者痰樣本的涂片、液體培養(yǎng)與SAT法的結(jié)果。使用SPSS 19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計學(xué)處理和分析。采用χ2檢驗比較痰涂片、液體培養(yǎng)與SAT法的陽性檢出率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；采用秩和檢驗分析以液體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時的SAT檢驗結(jié)果的敏感度、特異度的變化趨勢是否具有統(tǒng)計學(xué)意義；SAT與金標(biāo)準(zhǔn)(痰涂片或液體培養(yǎng))檢測方法進行一致性檢驗(Kappa檢驗)，K≤0.40時,表明一致性較差；0.400.80認(rèn)為兩者一致性極好。

結(jié) 果

在1036例患者痰樣本中，痰涂片陽性490例，培養(yǎng)陽性522例[培養(yǎng)陽性的時間為(28.37±9.58)d]，SAT陽性570例。涂片、培養(yǎng)及SAT的陽性檢出率分別為47.30%(490/1036)、50.39%(522/1036)、55.02%(570/1036)(表1)。

SAT與涂片總符合率為81.47%(844/1036)；SAT與液體培養(yǎng)的總符合率為84.17%(872/1036)。以液體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)SAT法的敏感度為88.89%(464/522),其中涂片(+)培養(yǎng)(+)、涂片(-)培養(yǎng)(+)、涂片(+)培養(yǎng)(-)、涂片(-)培養(yǎng)(-)患者中敏感度分別為93.92%(386/411)、70.27%(78/111)、60.76(48/79)、13.33%(58/435)；以液體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)SAT法的特異度為79.38%(408/514)；其中在涂片(-)培養(yǎng)(-)、涂片(+)培養(yǎng)(-)、涂片(-)培養(yǎng)(+)、涂片(+)培養(yǎng)(+)的患者中特異度分別為86.67%(377/435)、39.24%(31/79)、29.73%(33/111)、6.08%(25/411)，敏感度隨痰菌量增加而升高，特異度隨痰菌量增加而降低(Z=-23.635,P<0.05)。采用配對資料χ2檢驗對SAT法與痰涂片、培養(yǎng)進行比較，χ2值分別為32.505、13.470，P值均<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SAT法與痰涂片、培養(yǎng)檢測方法的結(jié)果進行一致性檢驗的Kappa值分別為0.63、0.68(表2)。

討 論

本研究結(jié)果顯示3種方法中，SAT法簡單快速，具有較高的敏感度。以液體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時，SAT的敏感度為88.89%(464/522),敏感度隨痰菌量增加而升高,在涂片(+)培養(yǎng)(+)患者中敏感度達93.92%(386/411),與文獻[11]報道相似；在菌陰繼發(fā)性肺結(jié)核中仍有13.33%(58/435)的陽性檢出率，與文獻報道在初診患者涂片陰性標(biāo)本采用SAT法的陽性檢出率為10%左右的結(jié)果相符[12]。這說明SAT法可提高涂陰患者的陽性檢出率，減少漏診，對于臨床診斷肺結(jié)核具有重要的意義。

以液體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時，SAT法的特異度為79.38%(408/514)，特異度隨痰菌量的升高而降低。由于部分繼發(fā)性肺結(jié)核患者間斷排菌，使SAT法的特異度受到不同程度的影響，陰性結(jié)果排除結(jié)核感染的能力下降。

痰涂片、培養(yǎng)及SAT法的陽性檢出率依次升高，SAT法較痰涂片和培養(yǎng)的陽性檢出率分別高7.72%(80/1036)、4.63%(48/1036)。SAT與痰涂片、培養(yǎng)檢測方法的結(jié)果進行一致性檢驗的Kappa值分別為0.63、0.68。說明SAT法與涂片、培養(yǎng)法比較具有較高的一致性，同時SAT法較傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)的陽性檢出率高，有助于早期快速發(fā)現(xiàn)傳染源、及時診治繼發(fā)性肺結(jié)核患者。

在涂片(+)培養(yǎng)(-)的79例患者中，SAT(+)48例，占60.76%(48/79)。有數(shù)據(jù)表明痰標(biāo)本中菌量少的情況下，痰涂片較培養(yǎng)的陽性檢出率略高，原因是痰涂片是濃集法且可反復(fù)多次檢查，而痰培養(yǎng)的前處理會對菌體的活力及數(shù)量有減損，從而導(dǎo)致涂片(+)培養(yǎng)(-)現(xiàn)象的發(fā)生。

有資料表明非結(jié)核分枝桿菌(NTM)和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC)在形態(tài)、臨床表現(xiàn)及X線特征具有極高的相似性，但由于二者的臨床治療方案有很大差別，大部分NTM對抗結(jié)核藥物具有耐藥性，因此錯誤的診斷往往會延誤治療[13-14]。本研究中痰涂片(+)痰培養(yǎng)(-)SAT(-)的31例患者中，證實NTM病4例，提示多次涂片(+)而且陽性級別“+”以上但SAT(-)的結(jié)果，高度可疑NTM感染，建議采用分子生物學(xué)方法進行分枝桿菌菌種鑒定，以正確區(qū)分NTM與MTB，避免誤診；對于早期診斷與精準(zhǔn)治療具有重要意義。

本研究中涂片(+)培養(yǎng)(+)SAT(-)的患者25例，占6.08%(25/411),而且本組患者的培養(yǎng)陽性時間為(28.37±9.58)d,普遍較長。多數(shù)為經(jīng)過反復(fù)治療，菌體活力下降，培養(yǎng)時復(fù)蘇時間長。在進行SAT法檢測時，初始模板少，擴增效率低，擴增曲線不規(guī)則易判為陰性；另外也不排除存在未知核酸擴增抑制物的可能。以上兩種情況與文獻報道一致[15]，因此建議臨床發(fā)現(xiàn)此類情況應(yīng)及時與實驗室人員聯(lián)系復(fù)檢，如果是由于核酸擴增抑制物的原因，經(jīng)標(biāo)本10倍稀釋后檢測，去除干擾后會得到標(biāo)準(zhǔn)的擴增曲線，對避免漏檢意義重大。

表1 1036例繼發(fā)性肺結(jié)核患者痰涂片、液體培養(yǎng)和SAT技術(shù)檢測結(jié)果(例數(shù))

表2 SAT法分別以痰涂片、液體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)比較所得出的敏感度和特異度等統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)結(jié)果

注 表中括號外數(shù)值為百分率(%)，括號內(nèi)分子與分母數(shù)值依據(jù)表1數(shù)據(jù)按照各指標(biāo)公式計算后得出

為了最大程度地降低誤差，提高各檢查方法結(jié)果的一致率，本研究統(tǒng)一采用陽性檢出率最高的晨痰樣本作為檢測標(biāo)本。但在日常臨床工作中難以做到一份痰樣同時進行多個項目的檢測(包括傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)及快速分子生物學(xué)檢查)，由于每個痰杯中的痰樣并不均一，出現(xiàn)有的結(jié)核檢測項目陽性，有的項目未檢出(除外每種檢測方法敏感度的差異)，導(dǎo)致產(chǎn)生同一患者同一時間橫向比對結(jié)果不相符現(xiàn)象。筆者了解到，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院借助醫(yī)院信息系統(tǒng)(HIS)和實驗室信息系統(tǒng)(LIS)，對患者血標(biāo)本進行全程條碼管理，同時建立自動化患者標(biāo)本運送和分配通道，實現(xiàn)一份標(biāo)本可同時檢測相同條件的多個檢測項目。同理，能否借助信息自動化平臺來將一個痰杯內(nèi)的痰樣混勻后，自動傳輸分配給不同的檢測平臺，來達到用一份痰液做幾項結(jié)核檢測項目，以此去除由于痰樣不均一(分析前質(zhì)量控制不達標(biāo))而產(chǎn)生的分析誤差？筆者期盼結(jié)核界也有類似的方法和策略解決工作中這個難題。

綜上所述，進入分子診斷時代，結(jié)核病的早期診斷也進入了一個新的時代，以16s RNA為靶標(biāo)的SAT技術(shù)在不同程度上提高了檢測結(jié)果的敏感度和精確度，2～3 h即可獲得檢測報告[16-17]。而且SAT檢測在耗時和檢測成本上均低于另一種快速分子檢測方法Xpert MTB/RIF法[18]，試驗要求較熒光PCR擴增法低[19]，在肺結(jié)核的早期診斷中是一種快速、準(zhǔn)確、敏感的方法[20]。因此，聯(lián)合應(yīng)用細(xì)菌學(xué)檢測及SAT分子生物學(xué)檢測方法，對早期診斷繼發(fā)性肺結(jié)核患者，盡早發(fā)現(xiàn)傳染源、及早有效實施治療管理、降低高危人群的感染風(fēng)險、保護易感人群等均具有重要意義。

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(本文編輯：薛愛華)

The application value of real time fluorescent nucleic acid amplification technology in patients with secondary pulmonary tuberculosis

HOUYan-jie*,FANGHong-xia,WEIMing,YANPeng,XUXue-wei,XUXin-xin,ZHANGBao-qing,LIUChun-tao,LIUYu-qin.

*HeilongjiangInfectiousDiseasePreventionandControlHospital,Harbin150500,China

LIUYu-qin,Email：liuyuqin_ssy@163.com

Objective To evaluate the application value of real time fluorescent nucleic acid amplification technology-simultaneous amplification and testing(SAT) in patients with secondary pulmonary tuberculosis. Methods One thousand and thirty six morning sputa were collected and detected with smear, culture and SAT technology from 1036 patients admitted in Heilongjiang Infectious Disease Prevention and Control Hospital during Jan. 2014 to Sep. 2015. The positive rate was tested with Chi-square and the consistency between SAT and other testing techniques were compared byKappatest.P<0.05 was considered significant difference. Results The positive rates were 55.02% (570/1036) in SAT, 47.30% (490/1036) in smear, and 50.39% (522/1036) in culture, respectively. The difference was significant statistically (χ2=32.505,13.470,P<0.05). TheKappavalues were 0.63 and 0.68 when compared SAT with smear and culture. Conclusion The positive rate in SAT is higher than those of smear and culture. SAT has high consistency when compared with smear and culture. It is helpful to screen and diagnose secondary pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary/secondary； Nucleic acid amplification techniques； Nucleic acid probes； Laboratory techniques and procedures； Comparative study

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.008

150500 哈爾濱，黑龍江省傳染病防治院(侯艷杰、蔚鳴、閆朋、許雪薇、許鑫鑫、張寶慶、劉春濤、劉玉琴)；深圳市龍華新區(qū)慢性病防治中心(房宏霞)

劉玉琴，Email：liuyuqin_ssy@163.com

2016-07-18)