劉銀萍 王杰 張俊仙 梁艷 李洪敏 吳雪瓊

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對(duì)異煙肼與丙硫異煙胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株檢測(cè)及相關(guān)基因突變的研究

劉銀萍 王杰 張俊仙 梁艷 李洪敏 吳雪瓊

目的 研究MTB對(duì)異煙肼(INH)和丙硫異煙胺(Pto)的耐藥情況，及從臨床標(biāo)本中的MTB臨床分離株直接檢測(cè)katG和inhA基因型的價(jià)值。方法 回顧性調(diào)查解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所2014年8月至2015年8月住院確診，并經(jīng)抗結(jié)核藥物治療有效的結(jié)核病患者，共104例。患者臨床標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)鑒定為MTB，然后通過(guò)絕對(duì)濃度法同時(shí)進(jìn)行INH和Pto藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)，并用基因芯片檢測(cè)MTBkatG和inhA基因型。結(jié)果 104例患者的MTB臨床分離株經(jīng)絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)顯示：20例(19.2%)對(duì)INH耐藥，其中3例高度耐藥、17例低度耐藥；5例(4.8%)對(duì)Pto耐藥，其中1例高度耐藥、4例低度耐藥；INH與Pto的交叉耐藥率20.0%(4/20)。以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)為對(duì)照，20例對(duì)INH耐藥患者中，基因芯片檢測(cè)10例(50.0%)發(fā)生katG基因315位點(diǎn)突變，3例(15.0%)發(fā)生inhA基因-15位點(diǎn)突變，1例(5.0%)發(fā)生雙基因突變；84例INH敏感患者中，7例(8.3%)發(fā)生katG基因315位點(diǎn)突變，5例(6.0%)發(fā)生inhA基因-15位點(diǎn)突變?；蛐酒瑱z測(cè)katG基因315位點(diǎn)突變預(yù)示MTB對(duì)INH耐藥的敏感度為55.0%(11/20)，特異度為91.7%(77/84)；inhA基因-15位點(diǎn)突變預(yù)示MTB對(duì)INH和Pto耐藥的敏感度分別為20.0%(4/20)和60.0%(3/5)，特異度分別為94.0%(79/84)和93.9%(93/99)。結(jié)論 大多數(shù)結(jié)核病患者的MTB臨床分離株對(duì)INH和Pto耐藥水平低，對(duì)Pto的耐藥率低，katG315和inhA-15基因突變與MTB對(duì)INH耐藥密切相關(guān)，inhA-15基因突變與MTB對(duì)Pto耐藥密切相關(guān)，應(yīng)用基因芯片可快速檢測(cè)臨床標(biāo)本中MTB的INH和Pto耐藥基因型。

分枝桿菌，結(jié)核； 異煙肼； 丙硫異煙胺； 抗藥性，細(xì)菌； 芯片分析技術(shù)

異煙肼(isoniazide，INH)是一線抗結(jié)核藥物，是結(jié)核病標(biāo)準(zhǔn)化療方案的重要組成藥物。根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，2014年全球約有48萬(wàn)例耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者，而我國(guó)約有5.7萬(wàn)例[1]。由此可見(jiàn)，制定有效的MDR-TB治療方案對(duì)于控制結(jié)核病疫情至關(guān)重要。結(jié)核分枝桿菌(MTB)對(duì)INH耐藥后，臨床上通常應(yīng)用丙硫異煙胺(protionamide，Pto)來(lái)代替INH組成治療方案[2]。Pto和乙硫異煙胺(ethionamide，Eto)均是異煙酸的衍生物，兩者與INH作用相似，有一定的交叉耐藥性[3]，可通過(guò)抑制MTB分枝菌酸的合成而發(fā)揮抗結(jié)核作用[4]。目前的研究已表明MTB耐INH主要與過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶編碼基因(katG)和烯酰基運(yùn)載蛋白還原酶的調(diào)控基因(inhA)突變有關(guān)[5]。MTB耐Eto主要是由于參與分枝菌酸合成的inhA編碼基因和啟動(dòng)子區(qū)域突變所致[6]。但目前尚未見(jiàn)MTB對(duì)Pto耐藥與inhA相關(guān)性的研究報(bào)道。因此，本研究將探討MTB對(duì)INH與Pto的耐藥情況，并研究應(yīng)用基因芯片從臨床標(biāo)本中直接檢測(cè)MTBkatG基因315位和inhA基因-15位基因型的臨床價(jià)值。

資料與方法

1.一般資料：對(duì)解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所2014年8月至2015年8月住院確診，并經(jīng)抗結(jié)核治療有效的結(jié)核病患者進(jìn)行回顧性調(diào)查。選擇104例鑒定為MTB感染，同時(shí)具有INH、Pto傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)和INH耐藥基因芯片檢測(cè)結(jié)果的患者作為研究對(duì)象。研究對(duì)象中，78例留取痰標(biāo)本、10例留取支氣管灌洗液、10例留取膿液、4例留取胸腔積液、2例留取病理組織。

2.分枝桿菌培養(yǎng)鑒定：按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]，應(yīng)用含對(duì)硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)的BACTEC 960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行分枝桿菌鑒別培養(yǎng)，選擇PNB陰性、TCH陽(yáng)性生長(zhǎng)物經(jīng)抗酸染色證實(shí)后鑒定為MTB的患者。

3.傳統(tǒng)分枝桿菌藥敏試驗(yàn)：按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]采用絕對(duì)濃度法進(jìn)行傳統(tǒng)的MTB藥敏試驗(yàn)。以MTB H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為質(zhì)控菌株，耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)：高、低度耐INH濃度分別為1 μg/ml和10 μg/ml；高、低度耐Pto濃度分別為10 μg/ml和100 μg/ml。

4.基因突變檢測(cè)：采用晶芯?MTB耐藥檢測(cè)基因芯片(購(gòu)自博奧生物集團(tuán)有限公司)，按照說(shuō)明書(shū)提供的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行PCR擴(kuò)增和芯片雜交。應(yīng)用MTB耐藥檢測(cè)芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行芯片掃描和結(jié)果判讀。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)算基因芯片檢測(cè)法的敏感度和特異度；計(jì)算各藥物耐藥發(fā)生率和交叉耐藥率，交叉耐藥率=交叉耐藥菌株數(shù)/INH耐藥菌總株數(shù)×100%；同一藥物高度耐藥和低度耐藥發(fā)生率間的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．基本情況：104例確診的結(jié)核病患者中，40例為肺結(jié)核，29例為肺結(jié)核并發(fā)結(jié)核性胸膜炎，17例為肺結(jié)核并發(fā)氣管、支氣管結(jié)核，5例為肺結(jié)核并發(fā)骨關(guān)節(jié)結(jié)核、5例為骨關(guān)節(jié)結(jié)核，3例為肺結(jié)核并發(fā)淋巴結(jié)結(jié)核，2例為肺結(jié)核并發(fā)結(jié)核性心包炎，結(jié)核性胸膜炎、淋巴結(jié)結(jié)核和腎結(jié)核各1例。男69例，女35例，平均年齡(45.1±19.5)歲。

2.耐藥情況：通過(guò)絕對(duì)濃度法同時(shí)對(duì)104例研究對(duì)象的臨床樣本進(jìn)行INH和Pto藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示：20例(發(fā)生率為19.2%)對(duì)INH耐藥，其中3例高度耐藥(發(fā)生率為2.9%)、17例低度耐藥(發(fā)生率為16.3%)，低度耐藥的發(fā)生率明顯高于高度耐藥(χ2=10.84，P=0.000)；5例(發(fā)生率為4.8%)對(duì)Pto耐藥，其中1例(發(fā)生率為1.0%)高度耐藥、4例(3.8%)低度耐藥，低度耐藥與高度耐藥發(fā)生率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.150)；4例INH與Pto交叉耐藥，耐藥率為20.0%(4/20)，見(jiàn)表1。

3.基因突變情況：應(yīng)用基因芯片檢測(cè)104例研究對(duì)象MTBkatG基因315位點(diǎn)和inhA基因-15位點(diǎn)突變情況，見(jiàn)表2。以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)為依據(jù)，20例INH耐藥患者中，基因芯片檢測(cè)10例(50.0%)發(fā)生katG基因315位點(diǎn)突變，3例(15.0%)發(fā)生inhA基因-15位點(diǎn)突變，1例(5.0%)發(fā)生雙基因突變，則基因芯片檢測(cè)katG基因315位點(diǎn)突變預(yù)示INH耐藥的敏感度為55.0%(11/20)，inhA基因-15位點(diǎn)突變預(yù)示INH耐受的敏感度為20.0%(4/20)，兩個(gè)耐藥基因檢測(cè)總的敏感度為70.0%(14/20)；84例INH敏感患者中，7例(8.3%)發(fā)生katG基因315位點(diǎn)突變，5例(6.0%)發(fā)生inhA基因-15位點(diǎn)突變，則基因芯片檢測(cè)katG基因315位點(diǎn)突變的特異度為91.7% (77/84), 檢測(cè)inhA基因-15位突變的特異度為94.0% (79/84), 兩個(gè)耐藥基因檢測(cè)總的特異度為85.7%(72/84)。INH耐藥基因檢測(cè)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一致率為82.6%(86/104)。

5例Pto耐藥患者中，基因芯片檢測(cè)只有3例發(fā)生inhA基因-15位點(diǎn)突變，檢測(cè)敏感度為60.0%(3/5)；99例Pto敏感患者中，基因芯片檢測(cè)6例(6.1%)發(fā)生inhA基因-15位點(diǎn)突變，檢測(cè)的特異度為94.0%(93/99)。PtoinhA耐藥基因檢測(cè)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一致率為92.3%(96/104)。

討 論

根據(jù)2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[8]，我國(guó)結(jié)核病患者對(duì)INH的耐藥率最高(28.6%)，對(duì)Pto的耐藥率為12.9%，均高于本研究的結(jié)果(分別為23%、5%)；也高于安徽省的INH耐藥情況(20.0%)，但Pto的耐藥情況相同(12.9%)[9]。李心德[10]分析了174株MDR-TB對(duì)二線抗結(jié)核藥的耐藥情況，結(jié)果顯示，Pto的耐藥率為12.9%。本研究Pto的低耐藥率可能系患者來(lái)源不同所致，也可能是表型藥敏試驗(yàn)所用的商品化培養(yǎng)基的Pto耐藥界限值較高，導(dǎo)致的假敏感。

INH是在過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的作用下轉(zhuǎn)化成活性型異煙酸而發(fā)揮抗結(jié)核作用的。研究已證明，MTB的katG基因突變會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶活性喪失或活性降低，使INH不能轉(zhuǎn)化為活性型而發(fā)生耐藥[4]。Seifert等[5]對(duì)2000—2013年來(lái)自49個(gè)國(guó)家的118篇關(guān)于INH耐藥基因突變的研究進(jìn)行系統(tǒng)綜述，發(fā)現(xiàn)全球INH耐藥菌株64%與katG基因315位點(diǎn)突變相關(guān)，19%由inhA基因-15位點(diǎn)突變所致。由于大多數(shù)MTB耐藥發(fā)生于katG基因315位點(diǎn)和inhA基因-15位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)已成為INH耐藥基因型檢測(cè)的主要位點(diǎn)。本研究結(jié)果也證實(shí)了這兩個(gè)位點(diǎn)的耐藥基因型檢測(cè)是可行的，并且以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)照，其具有較高的敏感度、特異度和一致率。本研究發(fā)現(xiàn)17例患者katG基因315位點(diǎn)突變，其中只有1例是高度耐藥株，其余均為低度耐藥株或敏感株。這是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)突變只是導(dǎo)致過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶活性降低，使INH轉(zhuǎn)換為異煙酸的效率降低，臨床加大劑量繼續(xù)用藥是有效的[11]。

表1 104例研究對(duì)象異煙肼和丙硫異煙胺傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 104例研究對(duì)象基因芯片檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的比較

Pto與Eto均為異煙酸的衍生物，因此，從原理上講，katG基因突變似乎與Pto和Eto無(wú)關(guān)。本研究中Pto耐藥株中僅見(jiàn)1例katG基因突變；Morlock 等[12]未發(fā)現(xiàn)katG基因突變與Eto耐藥相關(guān)。但Pto、Eto與INH轉(zhuǎn)化后的活性物質(zhì)作用相似，可抑制MTB分枝菌酸的合成。雖然本研究檢測(cè)Pto的耐藥株較少，但以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)為對(duì)照，基因型檢測(cè)具有較高的特異度和一致率，也初步提示Pto耐藥可能與inhA基因-15位點(diǎn)突變密切相關(guān)。針對(duì)此結(jié)論，筆者將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。這一結(jié)果也預(yù)示INH與Pto和Eto之間存在一定的交叉耐藥率。本研究中，inhA基因-15位點(diǎn)突變?cè)贗NH耐藥株中所占比例較小，且主要表現(xiàn)為低度耐藥；傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，INH與Pto的交叉耐藥率也只有20.0%；3例INH高度耐藥的患者Pto表現(xiàn)為敏感或低度耐藥。由此提示，INH耐藥尤其是無(wú)inhA基因突變患者可選擇Pto或Eto代替INH進(jìn)行治療[2]。

綜上所述，本研究大多數(shù)標(biāo)本中MTB對(duì)INH和Pto耐藥水平低，對(duì)Pto的耐藥率低，提示臨床上可應(yīng)用Pto代替耐藥的INH用于結(jié)核病治療；katG基因315位點(diǎn)和inhA基因-15位點(diǎn)突變與INH耐藥密切相關(guān)，inhA基因-15位點(diǎn)突變與Pto耐藥密切相關(guān)，應(yīng)用基因芯片快速檢測(cè)臨床標(biāo)本中MTB的INH和Pto耐藥基因型，可指導(dǎo)臨床合理用藥。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2015 [R/OL]. (2015-11-16)[2016-06-07]. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/.

[2] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì). 耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2015). 中國(guó)防癆雜志, 2015, 37(5): 421-469.

[3] Schaaf HS,Victor TC,Venter A,et al. Ethionamide cross- and co-resistance in children with isoniazid-resistant tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2009, 13(11): 1355-1359.

[4] Vilchèze C, Jacobs WR Jr. Resistance to isoniazid and ethionamide inMycobacteriumtuberculosis: genes, mutations, and causalities. Microbiol Spectr, 2014, 2(4): MGM2-0014-2013.

[5] Seifert M, Catanzaro D, Catanzaro A, et al. Genetic mutations associated with isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosis: a systematic review. PLoS One, 2015, 10(3): e0119628.

[6] Machado D, Perdig?o J,Ramos J,et al. High-level resistance to isoniazid and ethionamide in multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisof the Lisboa family is associated with inhA double mutations. J Antimicrob Chemother, 2013, 68(8): 1728-1732.

[7] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專(zhuān)業(yè)委員會(huì). 結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程. 北京:中國(guó)教育文化出版社, 2006: 55-57.

[8] 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組, 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告. 中國(guó)防癆雜志, 2012, 34(8): 485-508.

[9] 徐東芳, 王慶, 李孳, 等. 安徽省420株結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線和二線抗結(jié)核藥物藥敏結(jié)果分析. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2014, 30(1): 54-57.

[10] 李心德. 174株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)二線抗結(jié)核藥耐藥情況分析. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 35(13): 1732-1733,1748.

[11] Katiyar SK, Bihari S, Prakash S, et al. A randomised controlled trial of high-dose isoniazid adjuvant therapy for multidrug-resistant tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2008, 12(2): 139-145.

[12] Morlock GP, Metchock B, Sikes D, et al.ethA,inhA, andkatGloci of ethionamide-resistant clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(12): 3799-3805.

(本文編輯：李敬文)

A study on test and related genotypes of isoniazid-and-prothionamide-resistantMycobacteriumtuberculosisisolated from clinical specimens

LIUYin-ping,WANGJie,ZHANGJun-xian,LIANGYan,LIHong-min,WUXue-qiong.

ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,InstituteforTuberculosisResearch,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

WUXue-qiong,Email:xueqiongwu@139.com

Objective To investigate isoniazid (INH) and prothionamide (Pto) resistances inMycobacteriumtuberculosis(MTB), and to assess the value of direct detection ofkatGandinhAgenotypes in MTB isolated from clinical specimens. Methods A total of 104 hospitalized TB patients undergoing effective anti-MTB treatment from Institute for Tuberculosis Research, the 309th Hospital of Chinese PLA between August 2014 and August 2015 were retrospectively studied. Clinical specimens were identified as MTB by culture media containing nitrobenzoic acid (PNB) and thiophene-carboxylic acid hydrazide (TCH) and INH and Pto drug susceptibility tests were performed at the same time by absolute concentration method. The mutations of MTBkatGandinhAgenes were detected using gene chip. Results Of the 104 clinical specimens, the results of drug susceptibility tests showed that 20 cases (19.2%) were INH-resistant, in which 3 cases were with high-level resistant, and 17 cases were with low-level resistant; 5 cases (4.8%) were Pto-resistant, including 1 case with high-level and 4 cases with low-level resistance. The cross-resistant rate between INH and Pto was 20.0% (4/20). Compared to conventional drug susceptibility test, when using gene chip in the 20 TB patients with INH resistance, 10 cases (50.0%) hadkatG315 mutations, 3 cases (15.0%) hadinhA-15 mutations, and 1 case (5.0%) had the mutations atkatG315 andinhA-15. Of the 84 INH-sensitive TB patients, 7 cases (8.3%) hadkatG315 mutations, 5 cases (6.0%) hadinhA-15 mutations. The sensitivity and specificity ofkatG315 mutations detection by gene chip for INH-resistance MTB were 55.0% (11/20) and 91.7% (77/84), respectively. The sensitivities ofinhA-15 mutation for INH and Pto resistance were 20.0% (4/20) and 60.0% (3/5), respectively; and the specificities were 94.0% (79/84) and 93.9% (93/99), respectively. Conclusion Most MTB isolated from clinical specimens were at low level of INH and Pto resistance. The rate of Pto-resistant in MTB was also low. ThekatG315 andinhA-15 mutations were closely related with INH resistance, and theinhA-15 mutation was closely related with the Pto resistance. Using gene chip could rapidly detect the INH- and Pto-resistant genotypes of MTB in clinical specimens.

Mycobacteriumtuberculosis; Isoniazid; Prothionamide; Drug resistance, bacterial; Microchip analytical procedures

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.005

“十一五”國(guó)家重大傳染病專(zhuān)項(xiàng)(No.2008ZX10003-001)；軍隊(duì)醫(yī)學(xué)科技“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J050)；解放軍第三〇九醫(yī)院課題(2014MS-012)

100091 北京，解放軍第三〇九醫(yī)院 全軍結(jié)核病研究所全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

吳雪瓊，Email: xueqiongwu@139.com

2016-06-08)