王培+王蓓+魯義善+簡紀(jì)常+吳灶和

摘 要：實(shí)驗(yàn)采用原核表達(dá)方法成功獲得吉富羅非魚mIgD基因恒定區(qū)融合蛋白，同時(shí)利用純化的MIGD融合蛋白，制備了兔抗MIGD多克隆抗體。ELISA檢測MIGD融合蛋白效價(jià)高達(dá)1∶512 000，說明MIGD蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可以誘導(dǎo)羅非魚機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

關(guān)鍵詞：吉富羅非魚；mIgD；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號 S943 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）08-10-04

Abstract：This experiment adoptsed prokaryotic expression methods to successfully obtain the constant region mIgD gene fusion protein，and polyclonal antibody against mIgD fusion protein was raised in a New Zealand pedigree white rabbit immunized with the purified MIGD fusion protein and the antibodytiter reached 1∶512000.This shows that the MIGD protein has strong immunogenicity，tilapia body can be induced to produce a strong immune response.

Key words：GIFT strain of Nile tilapia；mIgD；Prokaryotic expression；Preparation of polyclonal antibody

IgD是免疫系統(tǒng)中重要的免疫因子，主要在成熟的B細(xì)胞產(chǎn)生[1]。在硬骨魚類中，IgD是繼IgM被發(fā)現(xiàn)后的第二種免疫球蛋白，不同種魚類IgD基因在結(jié)構(gòu)上存在較大的差異，主要是由于其重鏈恒定區(qū)基因經(jīng)過大量的剪切和復(fù)制，導(dǎo)致魚體IgD基因結(jié)構(gòu)差異較大。和IgM一樣，IgD基因根據(jù)其剪切方式的不同，也分為2種型，即膜結(jié)合型IgD（mIgD）和分泌型IgD（sIgD）。mIgD主要是在B細(xì)胞膜表面作為抗原識別受體參與到免疫應(yīng)答中，而sIgD則主要存在于血清和其它體液中，發(fā)揮著抗體的功能參與體液免疫中[2]。目前已經(jīng)有多種魚類的IgD已經(jīng)被報(bào)道出來[3-6]，但I(xiàn)gD功能的研究僅限于基因結(jié)構(gòu)的分析，其蛋白分子本身的功能卻研究很少。一般Ig主要分為多變區(qū)（VH）、恒定區(qū)（CH）以及跨膜區(qū)（TM）等區(qū)域，而恒定區(qū)（CH）為Ig分子中最為重要的區(qū)域。為了研究恒定區(qū)生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)對已經(jīng)獲得的吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）mIgD重鏈基因恒定區(qū)進(jìn)行克隆[7]，通過擴(kuò)增獲得編碼的mIgD恒定區(qū)的基因序列，利用原核表達(dá)的方法構(gòu)建融合表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)后獲取重組蛋白。通過制備重組蛋白的多克隆抗體，進(jìn)一步研究重組蛋白的免疫原性，同時(shí)對多抗的特異性進(jìn)行檢測，以期為羅非魚mIgD的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)載體及菌株 質(zhì)粒載體pET-32a（+）、受體菌菌株大腸桿菌DH5α、BL21均為本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 吉富羅非魚（體質(zhì)量為100g左右）采自湛江東海島養(yǎng)殖基地，健康、有活力；新西蘭純種大白兔（體質(zhì)量為2.1kg左右）購于廣東醫(yī)學(xué)院，暫養(yǎng)14d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 PCR儀：Bio-Rad公司；DYY-III-8B恒壓恒流電泳儀：北京六一電泳儀廠；GDS-8000凝膠圖象分析儀：美國基因公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎儀：HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海南榮有限公司；HisTrapTM HP蛋白純化柱：GE公司；BTI-MQX200酶標(biāo)儀，美國BIO-TEK公司；上海新諾儀器設(shè)備有限公司等。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 IPTG、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自Sigma公司，試驗(yàn)所需酶類均購自大連TaKaRa公司；DNA切膠回收試劑盒、GeneJET Gel ExtractionKit試劑盒購自美國Thermo公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（貨號：AB10058）購自生工生物工程（上海）有限公司；HRP-標(biāo)記的鼠抗His-tag單抗、山羊抗鼠IgG、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 吉富羅非魚mIgD基因恒定區(qū)原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)獲得的吉富羅非魚mIgD基因的cDNA全長序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物D-δ-F和D-δ-R，用來擴(kuò)增mIgD重鏈基因的恒定區(qū)序列δ1～δ7區(qū)域，將限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ、EcoRⅠ和對應(yīng)的保護(hù)堿基分別引入2條引物的5'端。通過常規(guī)PCR擴(kuò)增mIgD恒定區(qū)序列，通過回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選單克隆，測序驗(yàn)證，利用常規(guī)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒[8]。

1.2.2 大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化 將重組質(zhì)粒按照相應(yīng)比例（1∶100）接種于含有Amp+（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，適宜條件下培養(yǎng)，當(dāng)酶標(biāo)儀中的OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，樣品處理，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。分別設(shè)定28℃和37℃，IPTG濃度為0.2mmol/L誘導(dǎo)4h，離心后區(qū)上清液和下沉液SDS-PAGE分析；分別設(shè)定IPTG濃度為0.02～0.8mmol/L等8個(gè)濃度梯度，37℃誘導(dǎo)4h，處理樣品，SDS-PAGE分析；設(shè)定誘導(dǎo)時(shí)間分別為：0.5h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，37℃，IPTG濃度為0.05mmol/L，樣品處理，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.2.3 重組融合蛋白的提取與純化 最優(yōu)表達(dá)條件誘導(dǎo)后的菌液于冰上超聲破碎，直至菌液澄清。離心后取上清和沉淀進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。采用HisTrapTM HP親和層析柱純化蛋白，分別用含30、50、75、100、150、200、250和300mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脫樣品，并分別收集樣品，之后進(jìn)行傳統(tǒng)Western blot 檢驗(yàn)。

1.2.4 兔抗羅非魚MIGD多克隆抗體的制備 將購買的4月齡的新西蘭大白兔平均分成A組和B組，在動物進(jìn)行免疫前，抽取少量血液作為空白對照組，之后分別將A、B組中的新西蘭大白兔平均分為實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組采用皮下注射法分別對實(shí)驗(yàn)組大白兔注射免疫原，對陰性對照組注射同等劑量的PBS進(jìn)行免疫。三免后耳緣靜脈采血，并用ELISA檢測抗血清效價(jià)，免疫后第57天終放血，ELISA檢測抗血清效價(jià)達(dá)到要求，頸動脈采全血，制備多克隆抗體[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pET32-δ-D的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)設(shè)計(jì)的羅非魚mIgD恒定區(qū)引物，得到2160bp的恒定區(qū)片段。將mIgD基因的目的片段與pET-32a（+）載體連接、轉(zhuǎn)化。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32-δ-D進(jìn)行雙酶切鑒定，得到一條長約2 160bp的條帶（圖1），結(jié)果序列比對結(jié)果正確，并無移碼或錯配現(xiàn)象存在，表明原核表達(dá)載體pET32-δ-D構(gòu)建成功。

2.2 重組質(zhì)粒pET32-δ-D在BL21中的表達(dá)分析 重組質(zhì)粒pET32-δ-D轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可以表達(dá)出約99.9ku的融合蛋白（圖2），而mIgD恒定區(qū)的蛋白分子量為79.5ku，標(biāo)簽蛋白pET-32a的分子量約為20.4ku。將經(jīng)過不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒與未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖3）。通過對溫度、IPTG濃度及時(shí)間的優(yōu)化，確定重組質(zhì)粒pET32-δ-D最佳誘導(dǎo)條件為：28℃條件下，IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)3h。從圖3（A）中可以看到，細(xì)菌經(jīng)過超聲破碎后，重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，而在上清液中幾乎不存在。

2.3 重組融合蛋白的純化及鑒定 將pET32-δ-D重組蛋白在最佳誘導(dǎo)條件下提取包涵體，用HisTrapTM HP親和層析柱進(jìn)行純化。分別采用不同濃度的咪唑緩沖液洗脫，結(jié)果顯示，在250mmol/L咪唑濃度條件下洗脫純化效果最好（圖4）。Western Blot分析（圖5）顯示，純化后的pET32-δ-D重組融合蛋白可以與His-Tag單克隆抗體結(jié)合，蛋白大小一致，結(jié)合測序結(jié)果推斷，已成功表達(dá)出吉富羅非魚mIgD蛋白。

2.4 兔抗SIGM多克隆抗體的抗血清效價(jià)測定和特異性檢測 利用已純化的MIGD融合蛋白，按照常規(guī)方法制備了兔抗MIGD多克隆抗體。從酶標(biāo)儀在450nm波長下測得的OD值（表2）以及終放血后抗血清純化抗體效價(jià)檢測（圖6）中可以得出，B組新西蘭大白兔終放血后的抗血清按照1∶256 000稀釋時(shí)，血清效價(jià)值≥2.5×陰性值，檢測結(jié)果為陽性；同樣方法將A組終放血后抗血清按照1∶512 000稀釋時(shí)，檢測結(jié)果仍可判定為陽性。因此，ELISA檢測效價(jià)表明SIGM融合蛋白可以產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體，抗體效價(jià)約為1∶512 000。Western-blotting結(jié)果顯示制備的SIGM多克隆抗體具有較高的免疫原性（圖7），可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

3 討論與結(jié)論

近年來，人們對于Ig的研究不僅從基因克隆和組織表達(dá)等方面入手，還可以通過原核表達(dá)系統(tǒng)體外獲得量大、高效的重組融合蛋白，使這些重組蛋白直接應(yīng)用于蛋白生物學(xué)特性等基礎(chǔ)研究中。本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32-δ-D，再將經(jīng)過不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒與未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。通過對溫度、IPTG濃度、和時(shí)間等影響因素的優(yōu)化，確定重組質(zhì)粒的最佳誘導(dǎo)條件，從而得到大量高效的外源重組蛋白。隨著酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中微量物質(zhì)的大量應(yīng)用，高質(zhì)量的抗體制備也越來越受到重視[10]。其中單克隆抗體的制備備受推崇，在其擁有穩(wěn)定性好、充分性好等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)存在一定的局限性[11-12]，如制備過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力等。因此，目前廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中的主要是多克隆抗體[13]。在制備多抗的過程中，動物的選擇一般根據(jù)抗體的用途和量來決定，也與抗原本身的性質(zhì)有關(guān)，一般選擇哺乳動物或者是禽類為主[14]。如本實(shí)驗(yàn)所要獲得的SIGM多克隆抗體主要用于間接的標(biāo)記性診斷，因此選用異源的健康雄性新西蘭大白兔作為制備多抗的實(shí)驗(yàn)動物。為排除免疫應(yīng)答時(shí)所產(chǎn)生的個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)時(shí)常常將若干只兔子同時(shí)進(jìn)行免疫[15]。制備的抗體具有較高的抗體效價(jià)是在臨床診斷或者是治療病癥時(shí)的主要要求。實(shí)驗(yàn)室最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附法，也就是常說的ELISA檢測法[16-17]，ELISA檢測的抗體效價(jià)越高，其所具備的免疫原性就越好。

本實(shí)驗(yàn)利用傳統(tǒng)的多克隆抗體的制備方法得到的MIGD蛋白效價(jià)高達(dá)1：∶512 000，說明MIGD蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可以誘導(dǎo)羅非魚機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，可用于后續(xù)的研究當(dāng)中。

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（責(zé)編：張宏民）