楊文婷，黃士栩，徐文廣，吳士筠（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北武漢430000）

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超聲波輔助提取吳茱萸生物堿的工藝研究

楊文婷，黃士栩，徐文廣，吳士筠*
（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北武漢430000）

摘要：利用響應(yīng)曲面法對(duì)超聲波輔助法提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。以吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)方法，確定其最佳工藝。最佳條件為35倍體積的60 %乙醇、提取53 min，在此條件下，吳茱萸堿提取率為（0.398 9±0.001 5）%，吳茱萸次堿提取率為（0.761 1±0.001 1）%，與模型預(yù)測(cè)的理論值接近，說明模型可靠，響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取工藝可行。

關(guān)鍵詞：吳茱萸；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；超聲波輔助提取法；響應(yīng)曲面法

吳茱萸（Tetradium ruticarpum）是蕓香料植物吳茱萸的干燥成熟果實(shí)[1]，作為一種傳統(tǒng)中藥[2]，其藥用潛力很大。主要活性成分之一是吳茱萸堿和吳茱萸次堿，能抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛，并對(duì)心血管疾病、免疫系統(tǒng)、平滑肌等均有藥理作用[2]。隨著藥理研究的不斷深入，其在市場(chǎng)的應(yīng)用前景非常樂觀，目前已出口多個(gè)國(guó)家。對(duì)吳茱萸生物堿提取工藝的研究，可進(jìn)一步促進(jìn)其醫(yī)藥用途的開發(fā)，為中藥吳茱萸的現(xiàn)代化奠定良好的基礎(chǔ)。目前對(duì)其提取工藝的研究，主要采用熱浸法、加熱回流法、索氏提取法等[3-7]，本文通過效率高、時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單的超聲波輔助提取，結(jié)合響應(yīng)面曲面法建立模型[8]，以對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取的關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化，以建立安全、穩(wěn)定、高效的提取工藝，為其深入開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

DG120型四兩裝中藥材粉碎機(jī)：浙江省瑞安市春海藥材器械廠；752型紫外分光光度計(jì)、756PC型波長(zhǎng)掃描儀：上海光譜儀器有限公司；KQ-100E超聲波振蕩器：昆山市超聲儀器有限公司。

吳茱萸：湖北金新龍中藥飲片有限公司；吳茱萸堿對(duì)照品、吳茱萸次堿對(duì)照品：天津一方科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原材料預(yù)處理

吳茱萸藥材粉碎、過篩，石油醚脫脂4 h，除去溶劑，干燥備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吳茱萸堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取吳茱萸堿對(duì)照品2.5 mg，用乙酸乙酯配成100 μg/mL的吳茱萸堿母液。在200 nm～500 nm范圍進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，最大吸收波長(zhǎng)為268 nm。分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL母液，乙酸乙酯定容至25 mL，268 nm測(cè)吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吳茱萸堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A = 0.021 6C+0.000 2，R2=0.998 9。

吳茱萸次堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取吳茱萸次堿對(duì)照品2.1 mg，用乙酸乙酯配成42 μg/mL的吳茱萸堿母液。在200 nm～500 nm進(jìn)行掃描，最大吸收波長(zhǎng)為344 nm。分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL母液，乙酸乙酯定容至25 mL，344 nm測(cè)吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吳茱萸堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.122 4x- 0.002 7，R2= 0.999 5。

1.2.3提取液的制備

稱取1份吳茱萸，分別以30倍的溶媒倍數(shù)加入70 %乙醇，超聲50 min后抽濾，取濾液適當(dāng)稀釋后分別于268、344 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。若吸光度不在吳茱萸堿和吳茱萸次堿的線性范圍內(nèi)則，則適當(dāng)稀釋后再測(cè)定。

1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，確定乙醇濃度、提取時(shí)間、溶媒倍數(shù)3個(gè)因素的不同水平，見表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface expreiments

基于響應(yīng)面法的中心組合設(shè)計(jì)，以吳茱萸堿提取率和吳茱萸次堿提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度的確定

分別選取體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90 %的乙醇平行提取、測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1　乙醇濃度對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.1 Effect of ethol alcohol concentration on the extraction yield of evodiamine and rutecarpine

隨著乙醇濃度的上升，吳茱萸堿與次堿的提取率提高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60 %時(shí)提取率最大，在50 %至70 %范圍內(nèi)，提取率相對(duì)較高，從節(jié)約溶劑的角度考慮，選取50 %、60 %、70 %作為乙醇濃度這一因素的水平值。

2.1.2提取時(shí)間的確定

分別在超聲波處理30、40、50、60、70 min后，進(jìn)行后處理和含量測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2　提取時(shí)間對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.2 Effect of extracting time on the yield of evodiamine and rutecarpine

隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取率逐漸增加，不斷在向溶劑中溶出，而提取50 min后，提取率增幅度不明顯。從能效角度考慮，選擇50 min作為提取時(shí)間的中心值。

2.1.3溶媒倍數(shù)的確定

分別選取溶媒倍數(shù)為10、20、30、40、50時(shí)進(jìn)行提取測(cè)定，結(jié)果見圖3。

吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取率隨著溶媒倍數(shù)的增加有一定提高。若溶劑加入量過少，會(huì)導(dǎo)致吳茱萸生物堿無法完全溶出而損失；超聲波法對(duì)細(xì)胞有破損作用，在溶媒倍數(shù)達(dá)到30倍后，提取率增加不明顯，吳茱萸堿和次堿的提取已趨于平衡。

圖3　溶媒倍數(shù)對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.3 Effect of solvent times on the extraction yield of evodiamineand rutecarpine

2.2響應(yīng)曲面法歸方程為吳茱萸堿提取率Y1=-1.308 87+0.026 565X1+ 0.023078X2+0.017295X3-0.0000537X1X2+0.000018X1X3+ 0.00000525X2X3-0.000203X12-0.000185X22-0.00026X32；吳茱萸次堿提取率Y2=-2.7294+0.055719X1+0.047882X2+ 0.032485X3-0.0000898X1X2+0.0000453X1X3+0.000 006 5X2X3-0.000 438X12-0.000 403X22-0.000 513X32。

表2　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design and experimental results

2.3方差分析結(jié)果

吳茱萸堿提取的回歸模型方差分析結(jié)果見表3，模型F值=121.5，P＜0.000 1，說明模型極其顯著；失擬項(xiàng)F值=0.456 3，P=0.727 4＞0.05，說明模型失擬不顯著。R2=0.990 9，說明此模型能解釋99.09 %的響應(yīng)值變化，總體模型擬合良好。其中，X2、X3、X1X2、X12、X22和X32的P值達(dá)到0.05以下，影響非常顯著，其余項(xiàng)影響均不顯著，說明溶媒倍數(shù)、提取時(shí)間以及乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)吳茱萸次堿的提取率影響較大。

表3　吳茱萸堿的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface model about evodiamine

對(duì)吳茱萸次堿提取的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4　吳茱萸次堿的方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface model about rutecarpine

模型F值=835，P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項(xiàng)F值=3.490，P=0.093 8＞0.05，說明由于純誤差而導(dǎo)致的失擬情況不顯著；校準(zhǔn)系數(shù)R2=0.998 7，說明此模型能解釋99.87 %的響應(yīng)值變化，該模型擬合程度較好。在此模型中，X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22和X32的P值達(dá)到0.05以下，對(duì)吳茱萸次堿提取率的影響非常顯著，說明溶媒倍數(shù)和提取時(shí)間及乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)吳茱萸次堿的提取影響較大。

根據(jù)2.3中方差分析結(jié)果，乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)吳茱萸次堿提取率影響顯著，為進(jìn)一步研究其交互作用，利用等高線圖和三維曲線圖進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖4。

圖4　乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)吳茱萸次堿提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.4 The contour line and response surface curve of the interaction between ethol concentration and extracting time to rutaecarpine

等高線圖呈橢圓形，橢圓越扁平，說明其交互作用影響越大；響應(yīng)面陡峭，說明吳茱萸次堿對(duì)乙醇濃度和提取時(shí)間的變化敏感。

2.4驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)方程擬合出最佳條件為：溶媒倍數(shù)34.59、提取時(shí)間53.05 min、乙醇濃度59.87 %，此條件下，吳茱萸堿為0.402 3 %，吳茱萸次堿為0.762 2 %。根據(jù)試驗(yàn)可行性做微調(diào)，在35倍體積的60 %乙醇中，超聲波輔助提取53 min，平行試驗(yàn)3次，吳茱萸堿提取率為（0.398 9±0.001 5）%，吳茱萸次堿提取率為（0.761 1± 0.0011）%，與曲線擬合出的理論值接近。

3　結(jié)論

本文利用超聲波輔助溶劑提取吳茱萸中的生物堿，超聲波能破損植物細(xì)胞，使其中的吳茱萸堿和次堿充分釋放，使提取充分；超聲波輔助提取相對(duì)傳統(tǒng)熱浸或加熱回流可以縮短提取時(shí)間，簡(jiǎn)單易行；且提取溶劑選用廉價(jià)、安全的乙醇溶液，成本低、無污染，對(duì)后期溶劑殘留檢測(cè)要求較低。

響應(yīng)面曲面法有效克服了正交試驗(yàn)上只能處理離散水平的值的確定。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，利用中心組合設(shè)計(jì)模型建立了吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取的回歸模型，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和驗(yàn)證試驗(yàn)表明模型能可靠預(yù)測(cè)兩者的提取率。模型預(yù)測(cè)條件為溶媒倍數(shù)34.59、提取時(shí)間53.05 min、乙醇濃度59.87 %，所得吳茱萸堿提取率為0.398 9 %，吳茱萸次堿提取率為0.761 1 %，與理論值接近。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extracting of Evodiamine and Rutaecarpine

YANG Wen-ting，HUANG Shi-xu，XU Wen-guang，WU Shi-jun*
（Environmental and Biological Engineering College of Wuhan Technology and Bussiness University，Wuhan 430065，Hubei，China）

Abstract：The optimum extraction conditions of evodiamine and rutaecarpine from herbs were studied by response curve method. The optimal conditions of ultrasonic-assisted extraction were obtained by one-factor experiment and central composite design，which were 35 times the volume of 60 % ethol alcohol and extracting 53 min. Under the yield of evodiamine was（0.398 9±0.001 5）%，and rutaecarpine was（0.761 1±0.001 1）%，which were consistent with the theory value. The results showed that the model was reliable，and the optimazion method for the extraction was effective.

Key words：Tetradium ruticarpum；evodiamine；rutecarpine；ultrasonic-assisted extraction method；response surface design

收稿日期：2015-03-29

*通信作者:吳士筠（1950—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：天然產(chǎn)物提取及其活性研究。

作者簡(jiǎn)介：楊文婷（1983—），女（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取及其活性研究。

基金項(xiàng)目：武漢工商學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目（A2014018）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.013