何自強(qiáng)，張惠玲，李傳坤

(武漢生物工程學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程系，湖北 武漢 430415)

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黃芩中黃芩苷提取的工藝研究

何自強(qiáng)，張惠玲，李傳坤

(武漢生物工程學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程系，湖北 武漢 430415)

摘要:以黃芩為原料、甲醇為提取劑，采用醇提酸沉法從黃芩中提取黃芩苷.通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探討了甲醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)醇提條件對黃芩苷提取率的影響，結(jié)合直觀分析和方差分析，確定最佳提取條件：甲醇濃度為65%，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為2.5 h，料液比為1∶10，黃芩苷提取率可達(dá)到23.03%.該方法提取率高，純度高，重現(xiàn)性好.

關(guān)鍵詞:黃芩苷；提??；醇提酸沉法；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

黃芩(RadixScutellariae)為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorig)的干燥根[1]，其主要活性成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷等[2-4].其中黃芩苷(baicalin)是從黃芩根中提取分離出來的一種黃酮類化合物，別名黃芩甙，淡黃色針晶或粉末，分子式為C21H18O11，熔點(diǎn)223～225 ℃[5-7].

黃芩苷具有一定的脂溶性,在不同的溶劑中溶解度差異較大[6].黃芩苷易溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶，微溶于甲醇、乙醇、熱冰醋酸，難溶于甲酸、乙酸、丙酮，幾乎不溶于水、乙醚、苯、氯仿等溶劑[6-7].黃芩苷有羧基呈酸性，可溶于NaHCO3、Na2CO3和NaOH等堿性溶液，但在堿性溶液中不穩(wěn)定，漸變成暗紅色[6-7].

黃芩苷具有顯著的生物活性，具有清熱解毒、抑菌抗炎、降壓、鎮(zhèn)靜、利尿、利膽、抗變態(tài)反應(yīng)、抗癌等作用，在臨床醫(yī)學(xué)已占有重要的地位[8-10].同時(shí)，黃芩苷還能吸收紫外線，清除氧自由基，抑制黑色素的生成，可作為一種功能性原料用于化妝品中[9,11].因此，黃芩苷具有較高的開發(fā)前景.

目前，黃芩苷的提取方法主要有溶劑提取法、超聲波提取法、微波提取法和超臨界流體提取法等[10,12].從目前已發(fā)表的文獻(xiàn)看，溶劑提取法以乙醇作提取劑居多，但甲醇提取未見報(bào)道，而黃芩苷在甲醇中溶解度高于乙醇[6].

筆者以黃芩為原料、甲醇為提取劑，采用醇提酸沉法從黃芩中提取黃芩苷.以黃芩苷提取率為評價(jià)指標(biāo)，重點(diǎn)探討了醇提過程中甲醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)單因素對黃芩苷提取率的影響，再以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)合直觀分析和方差分析確定最佳工藝條件.

1材料與方法

1.1材料與試劑

黃芩，購于武漢市陽邏心連心大藥房；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)，上海伊卡生物有限公司.甲醇、無水乙醇、HCl、NaOH均為分析純.

1.2儀器與設(shè)備

AUY120電子天平,日本島津公司；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī),長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；RE-52 AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海嘉鵬科技有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科技有限公司；XT-4雙目顯微熔點(diǎn)測定儀,北京泰克儀器有限公司.

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1黃芩苷的提取工藝

1.3.1.1黃芩苷的提取[10,13]

稱取5.0 g黃芩粗粉，置于圓底燒瓶中，加入一定體積的某濃度(體積分?jǐn)?shù))的甲醇溶液，浸泡過夜；將黃芩粗粉液回流提取一定時(shí)間后，抽濾，濾液減壓蒸餾，得濃縮液；將濃縮液加熱至80 ℃，用10%的HCl溶液調(diào)節(jié)pH為1.5～2.0，保溫30 min后，室溫靜置12 h，離心機(jī)離心5 min，轉(zhuǎn)速為7 500 r·min-1,棄去上清液；將沉淀移入燒杯中，加入10倍水，充分?jǐn)嚢枋钩蔀榫鶆虻幕鞈乙海渭?0%NaOH溶液調(diào)pH至6.5～7，靜置15 min后，離心，棄去沉淀；將上清液加熱至40 ℃，攪拌下加入等體積與浸泡液濃度相同的甲醇溶液，混合均勻，靜置10 min，離心，棄去沉淀；將上清液用HCl溶液調(diào)節(jié)pH為1.5～2.0，放置析出沉淀.抽濾后，沉淀用蒸餾水洗2～3次，抽干，60 ℃以下干燥，得粗制黃芩苷，稱重，計(jì)算提取率.

1.3.1.2黃芩苷的精制[14]

稱取黃芩苷粗品，加10倍量水?dāng)嚢杈鶆颍?0%NaOH溶液調(diào)pH為 6.5～7，黃芩苷全部溶解后，加活性炭適量拌勻，80 ℃水浴保溫30 min，抽濾除去活性炭，濾液用濃HCl調(diào)至pH為1～2，加入等體積95%乙醇(黃芩苷在甲醇和乙醇中的溶解度分別為1.569 mg·mL-1和1.458 mg·mL-1[4]，黃芩苷在乙醇中的溶解度比甲醇小.因此，重結(jié)晶時(shí)選用乙醇)，50 ℃水浴保溫30 min，析出沉淀，放置過夜，抽濾，少量乙醇洗滌沉淀，抽干，60 ℃以下干燥，得精制黃芩苷，測其熔點(diǎn).

1.3.2黃芩苷最大吸收波長的確定[15-16]

精確稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，溶于20 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中.準(zhǔn)確移取5 mL上述溶液，置于10 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，配成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液.

準(zhǔn)確移取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，用50%乙醇定容至10 mL容量瓶中.以50%乙醇溶液作為參比液，測其吸光度，得最大吸收波長為278 nm(見圖1).

圖1黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液波長與吸光度的關(guān)系
Fig.1The relationship between wavelength and absorbance of standard solution of baicalin

1.3.3黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[16]

分別移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用50%的乙醇定容后，在278 nm波長下測吸光度，以質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2).該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A=0.041 3C+0.065 6，R2=0.998 9.

圖2黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.2The standard cure of baicalin

1.3.4黃芩苷含量的測定

準(zhǔn)確稱取30 mg黃芩苷產(chǎn)品，50%乙醇溶液溶解后，定容至10 mL容量瓶中，然后，精確移取0.05 mL于10 mL容量瓶中，定容、搖勻，在278 nm波長下測其吸光度.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算黃芩苷含量，再求出黃芩苷產(chǎn)品提取率.

黃芩苷含量和提取率的計(jì)算公式如下

(1)

(2)

其中：X為黃芩苷的含量(%)；Y為黃芩苷的提取率(%)；C為樣品溶液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；V為測量液的體積(mL)；n為樣品稀釋的倍數(shù)；m1為測吸光度所用的黃芩苷產(chǎn)品的質(zhì)量(mg)；m2為黃芩苷產(chǎn)品的質(zhì)量(mg)；m0為黃芩粗粉的質(zhì)量(mg).

2結(jié)果與討論

2. 1甲醇濃度對黃芩苷提取率的影響

稱取黃芩粗粉5 g，分別用40%，50%，60%，70%，80%的甲醇溶液浸泡過夜后回流提取，固定其他3個(gè)因素：料液比1∶10、提取時(shí)間2 h、提取溫度80 ℃.按1.3.4的方法測定提取物含量，計(jì)算黃芩苷提取率，考察甲醇濃度對黃芩苷提取率的影響.結(jié)果如圖3所示.

圖3甲醇濃度對黃芩苷提取率的影響
Fig.3Effect of methanol concentration on the extraction rate of baicalin

由圖3可知，甲醇濃度為40%時(shí)，黃芩苷提取率僅2.78%，隨著甲醇濃度增大，提取率迅速提高；甲醇濃度為60%時(shí)，黃芩苷提取率達(dá)到最大值；繼續(xù)增加甲醇濃度，黃芩苷提取率下降.低濃度時(shí)，甲醇極性較大，鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、黏液等高分子水溶性雜質(zhì)的溶出量增加，黃芩苷提取率較低；甲醇濃度達(dá)到60%，甲醇水溶液極性與黃芩苷極性相近，利于黃芩苷的溶出；甲醇濃度高于60%時(shí)，甲醇溶液極性較小，黃芩苷溶出量急劇下降.綜合考慮各因素，確定最佳甲醇濃度為60%.

2.2提取溫度對黃芩苷提取率的影響

稱取黃芩粗粉5 g，提取溫度分別為50，60，70，80，90 ℃，固定其他3個(gè)因素：甲醇溶液濃度60%，回流提取2 h，料液比1∶10.按1.3.4的方法測定提取物含量，計(jì)算黃芩苷提取率，考察提取溫度對黃芩苷提取率的影響.結(jié)果如圖4所示.

圖4提取溫度對黃芩苷提取率的影響
Fig.4Effect of extraction temperature on the extraction rate of baicalin

由圖4可知，提取溫度低于70 ℃，黃芩苷提取率隨溫度升高而下降，70 ℃后提取率迅速增加；80 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大值.說明在80 ℃時(shí)，黃芩苷在溶液中的溶解度最大；而高于80 ℃時(shí)，可能造成黃芩苷部分分解，導(dǎo)致提取率下降.綜合考慮各因素，確定最佳提取溫度為80 ℃.

2.3提取時(shí)間對黃芩苷提取率的影響

稱取黃芩粗粉5 g，提取時(shí)間分別為1，2，3，4，5 h，固定其他3個(gè)因素：甲醇溶液濃度60%，料液比1∶10，提取溫度80 ℃.按1.3.4的方法測定提取物含量，計(jì)算黃芩苷提取率，考察提取時(shí)間對黃芩苷提取率的影響.結(jié)果如圖5所示.

圖5提取時(shí)間對黃芩苷提取率的影響
Fig.5Effect of extraction time on the extraction rate of baicalin

由圖5可知，提取時(shí)間在1～2 h時(shí)，黃芩苷提取率增幅較大，2 h時(shí)達(dá)到最大值.超過2 h，黃芩苷提取率迅速下降.可能隨著提取時(shí)間的增加，黃芩中的鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、黏液等高分子水溶性雜質(zhì)的溶出量增加，將黃芩苷分子包裹起來，阻止了黃芩苷向溶液中擴(kuò)散，導(dǎo)致黃芩苷提取率下降.

2.4料液比對黃芩苷提取率的影響

稱取黃芩粗粉5 g，料液比分別為1∶8，1∶9，1∶10，1∶11，1∶12，固定其他3個(gè)因素：甲醇溶液濃度60%，回流提取2 h，提取溫度80 ℃.按1.3.4的方法測定提取物含量，計(jì)算黃芩苷提取率，考察料液比對黃芩苷提取率的影響.結(jié)果如圖6所示.

圖6料液比對黃芩苷提取率的影響
Fig.6Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of baicalin

由圖6可知，料液比在1∶8～1∶11之間時(shí)，黃芩苷提取率逐漸增大，因?yàn)榱弦罕仍酱螅S芩粗粉與有機(jī)溶劑的接觸面積越大，有利于黃芩苷的析出.料液比達(dá)到1∶11時(shí)，提取率最大，說明在此料液比下，大部分黃芩苷已被浸提出來.繼續(xù)增大料液比，黃芩苷提取率緩慢下降，可能是鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、黏液等高分子水溶性雜質(zhì)溶出，料液比過大，消耗的溶劑量增多，濃縮、干燥能耗增加，生產(chǎn)成本增大.綜合考慮各因素，確定最佳料液比為1∶11.

2.5最佳工藝條件的選擇

選取甲醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、料液比(D)作為參考因素，設(shè)計(jì)3水平，以黃芩苷提取率為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，通過直觀分析和方差分析確定黃芩苷提取的最佳工藝.因素水平表見表1，正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3.

表1　正交因素水平表

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)及直觀分析結(jié)果

續(xù)表2

表3　黃芩苷提取率方差分析結(jié)果

注：F0.01(2,2)=99，F(xiàn)0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.1(2,2)=9.

由表2直觀分析結(jié)果可知：影響黃芩苷提取率的因素按影響程度由大到小排列為RA>RB>RC>RD,并得到最佳提取工藝為A3B2C3D1，即為甲醇濃度65%，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶10.由表3方差分析結(jié)果可知：F0.01(2,2)

直觀分析結(jié)果與方差分析結(jié)果一致.

2.6黃芩苷提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以黃芩苷提取的最佳工藝進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證提取工藝的穩(wěn)定性.即稱取黃芩粗粉5 g，用濃度65%的甲醇溶液浸泡、回流提取，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶10.按上述工藝提取黃芩苷，結(jié)果見表4.

表4　黃芩苷提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表4可知，以最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，黃芩苷的提取率穩(wěn)定，重現(xiàn)性好.

3結(jié)束語

筆者以黃芩為原料、甲醇為提取劑，采用醇提酸沉法從黃芩中提取黃芩苷，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了甲醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)因素對黃芩苷提取率的影響，結(jié)合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定最佳提取條件：甲醇濃度為65%，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為2.5 h，料液比為1∶10，黃芩苷提取率最大達(dá)到23.03%.雷燕妮等[1]以乙醇提取黃芩苷，提取率為12.32%；周芳等[6]采取醇提酸沉法提取黃芩苷，提取率為18.39%；馬爽等[15]以乙醇為提取劑，采用超聲波法提取黃芩苷，提取率為10.05%.與已報(bào)道的文獻(xiàn)相比，該方法簡單可行，黃芩苷提取率較高，且重現(xiàn)性好.

黃芩苷在甲醇中的溶解度高于乙醇[6]，以甲醇作提取劑可提高黃芩苷的提取率.黃芩苷幾乎不溶于水，而甲醇可與水以任意比例互溶，因此粗制的黃芩苷可通過多次水洗去除提取時(shí)殘留的甲醇.精制后的黃芩苷，用XT-4雙目顯微熔點(diǎn)測定儀測其熔點(diǎn)為219～223 ℃，與理論值223～225 ℃[4]相近，說明該工藝條件下，提取后的黃芩苷純度較高.如用于工業(yè)化生產(chǎn)，后處理較簡單，可直接用于后續(xù)研究.

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(責(zé)任編輯于敏)

Research on extracting technology of baicalin fromScutellariabaicalensisGeorgi

HE Ziqiang, ZHANG Huiling, LI Chuankun

(Department of Chemical and Environmental Engineering, Wuhan Bioengineering Institute, Wuhan 430415, China)

Abstract:Taking Radix Scutellariae as raw material and methanol as extracting agent, baicalin was extracted from Scutellaria baicalensis Georgi by methanol extraction and acid precipitation method. The influences of concentration of methanol, extraction temperature, extraction time and solid-liquid ratio were studied through the single factor test and orthogonal test. The optimum extraction conditions were determined as follows: concentration of methanol 65%, extraction temperature 80 ℃, extraction time 2.5 h and ratio of solid-to-liquid 1∶10, combining with visual analysis and analysis of variance. The extraction rate was 23.03% under these conditions. High extraction rate, high purity and good reproducibility can be got.

Key words:baicalin; extraction technology; methanol extraction and acid precipitation method; single factor test; orthogonal test

中圖分類號(hào)：O658,TQ041

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1000-2162(2016)03-0073-07

作者簡介：何自強(qiáng)(1976-)，男，湖北隨州人，武漢生物工程學(xué)院講師.

基金項(xiàng)目:武漢市教育局資助項(xiàng)目(2011077)；校級教研項(xiàng)目(2013JY Ⅱ04)

收稿日期：2015-05-23

doi:10.3969/j.issn.1000-2162.2016.03.012