倪　原，劉凱濤，倪中辰，趙　陽，王紅娟，魏　靜（．西安工業(yè)大學(xué)電子信息工程學(xué)院，西安700；．西安啟源機(jī)電裝備股份有限公司，西安7008）

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熒光標(biāo)識(shí)生物分子檢測系統(tǒng)研究及性能分析*

倪原1，劉凱濤1，倪中辰2，趙陽1，王紅娟1，魏靜1
（1．西安工業(yè)大學(xué)電子信息工程學(xué)院，西安710021；2．西安啟源機(jī)電裝備股份有限公司，西安710018）

摘 要：為了確定待測樣品中是否存在某種特定的基因、蛋白質(zhì)，設(shè)計(jì)了一種能夠?qū)晒馓结槝?biāo)識(shí)的生物分子進(jìn)行檢測的熒光偏振系統(tǒng)．本文分析了分光光度法、共振光散射分析法所存在的問題和熒光偏振檢測的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，研究了熒光偏振檢測系統(tǒng)的原理，設(shè)計(jì)了檢測光路和測控系統(tǒng)，并進(jìn)行了大量的生物檢測實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該檢測系統(tǒng)能夠確定待測樣品中是否存在需要檢測的物質(zhì)，其測試的重復(fù)性誤差小于3%，正確率可達(dá)到100%，孔位測試不均勻性小于2%．

關(guān)鍵詞：熒光；偏振光；檢測系統(tǒng)；生物分子

基金資助：陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（07JC06）

在現(xiàn)代的臨床疾病診斷、環(huán)境保護(hù)等方面，經(jīng)常會(huì)遇到針對(duì)特定的基因、蛋白質(zhì)存在的檢測問題．在該系統(tǒng)研制之初，國外大半數(shù)醫(yī)療單位已經(jīng)裝備了該類系統(tǒng)，國內(nèi)僅有少量此類系統(tǒng)，大多分布在有影響的醫(yī)療單位，而且主要是以進(jìn)口為主，價(jià)格昂貴，除此之外，現(xiàn)有該類系統(tǒng)大多僅能進(jìn)行基因檢測，檢測樣品的數(shù)量和范圍受到限制，且易產(chǎn)生假陽性，因此迫切需要研制出成本低、檢測數(shù)量多、結(jié)果準(zhǔn)確的熒光偏振檢測系統(tǒng)．該類儀器在國內(nèi)具有良好的發(fā)展前景，產(chǎn)生的效益不可低估［1］．文獻(xiàn)［2-3］介紹了分光光度法，他是通過二苯胺與樣品結(jié)合后產(chǎn)生有色產(chǎn)物，然后對(duì)有色產(chǎn)物進(jìn)行檢測得到結(jié)果的方法，該方法準(zhǔn)確度高，但耗時(shí)長、靈敏度低且受干擾的可能性大．文獻(xiàn)［4］介紹了共振光散射分析法，它是一項(xiàng)在普通熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行測量的光散射分析方法，該方法有較高的靈敏度和選擇性，但檢測自動(dòng)化程度較低．文中針對(duì)分光光度法所存在的不能進(jìn)行高通量檢測、靈敏度低和共振光散射分析法所存在自動(dòng)化程度低、檢測成本高等缺點(diǎn)，采用熒光偏振原理，設(shè)計(jì)了一種熒光偏振檢測系統(tǒng)．

1　熒光偏振原理

熒光偏振值［5］是利用垂直方向的偏振光激發(fā)熒光分子，然后測量發(fā)射偏振光在水平方向和垂直方向的熒光強(qiáng)度值，則有

式中：P為熒光偏振值；N和M分別為偏振光在水平和垂直方向熒光強(qiáng)度值．

熒光偏振值與熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比，分子量小的，運(yùn)動(dòng)速度快，P值小；分子量大的，運(yùn)動(dòng)速度慢，P值大，因此，當(dāng)熒光標(biāo)示物通過生化反應(yīng)與要檢測的分子結(jié)合后，分子量極大，P值就大，當(dāng)樣品中無該檢測物質(zhì)時(shí)，P值就?。虼擞墒剑?）所測得的熒光偏振值（P）的大小，即可確定待測樣品的性質(zhì)．

熒光偏振檢測過程：光源發(fā)出的光經(jīng)過激發(fā)濾光器和起偏振器后，通過激發(fā)濾光器和起偏振器的作用，照射到樣品表面的是固定波長、固定方向的光，而樣品發(fā)出的是另一波長的光，該光經(jīng)過檢偏器和發(fā)射濾光器后，進(jìn)入PMT（光電倍增管）的檢測小窗中［6］．由于樣品性質(zhì)的不同，表現(xiàn)出光的偏振大小也不同，因此由式（1）可知將激發(fā)光的方向定為某一固定的方向，通過測出發(fā)射光各個(gè)方向的強(qiáng)弱便可得知樣品的性質(zhì)．

2　熒光偏振系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)

2．1 系統(tǒng)整體架構(gòu)

熒光偏振檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的功能主要包括：①樣本自動(dòng)選擇及位置控制；②光源光強(qiáng)自動(dòng)調(diào)整；③激發(fā)濾光片自動(dòng)選擇；④發(fā)射濾光片自動(dòng)選擇；⑤熒光信號(hào)采集及信號(hào)處理；⑥與上位機(jī)通信．根據(jù)功能需求所設(shè)計(jì)系統(tǒng)由主控制器、光源、激發(fā)光路、發(fā)射光路、步進(jìn)電機(jī)、電機(jī)驅(qū)動(dòng)器、光電倍增管、光電二極管等裝置組成．選擇ARM LPC1768處理器作為主控制器，根據(jù)光強(qiáng)要求采用80 W鹵素?zé)糇鳛楣庠聪到y(tǒng)中使用光電倍增管進(jìn)行熒光信號(hào)的采集，靈敏度高．由于不同樣本中所加熒光物質(zhì)不同，激發(fā)和發(fā)射的光波長也不同．因此，激發(fā)光路和發(fā)射光路設(shè)計(jì)有多種濾光片組合，根據(jù)需要自動(dòng)選擇．各光路中的鏡片位置及樣品盤位置控制由步進(jìn)電機(jī)及細(xì)分驅(qū)動(dòng)電路和機(jī)械定位裝置實(shí)現(xiàn)，不僅位置控制精確，而且避免了人工操作所帶來的污染．在檢測過程中，需要保證激發(fā)光的亮度不變，因此使用光電二極管采集光源的亮度變化，通過處理器控制光源驅(qū)動(dòng)電路使激發(fā)光亮度恒定．系統(tǒng)整體架構(gòu)如圖1所示．

圖1　系統(tǒng)整體架構(gòu)Fig．1 System framework

2．2 主控制電路設(shè)計(jì)

在設(shè)計(jì)時(shí)，為了簡化外圍電路設(shè)計(jì)，提高系統(tǒng)的集成度、可靠性同時(shí)能夠得到較快的運(yùn)算處理速度，因此選用了基于Cortex-M3內(nèi)核的LPC1768為微控制器．ARM Cortex-M3 CPU具有三級(jí)流水線和哈佛架構(gòu)，帶獨(dú)立的本地指令和數(shù)據(jù)總線以及用于外設(shè)的性能稍低的第三條總線，ARM Cortex-M3 CPU還包含一個(gè)支持隨機(jī)跳轉(zhuǎn)的內(nèi)部預(yù)取指單元．內(nèi)置了512 KB的Elash存儲(chǔ)器、64 KB的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)器；4個(gè)UART；8通道的12位ADC、10位DAC；4個(gè)通用定時(shí)器；6輸出的通用PWM；帶獨(dú)立的電池供電的超低功耗RTC以及多達(dá)70個(gè)的I／O引腳［7］．LPC1768的最小系統(tǒng)主要由晶振、電源、復(fù)位以及JTAG電路組成，處理器的P2．0-P2．9端口，通過EIO2DIR寄存器設(shè)置為輸出端口，與步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路相連接，用以控制步進(jìn)電機(jī)，系統(tǒng)因?yàn)槭褂幂^多步進(jìn)電機(jī)，可以使用其他端口進(jìn)行類似設(shè)置；通過EIO0DIR、EIO0SET、EIO0CLR寄存器對(duì)P0．4-P0．10進(jìn)行輸入輸出以及初始值的設(shè)置，將其與A／D轉(zhuǎn)換器連接，用以將采集的熒光信號(hào)和光源亮度信號(hào)變?yōu)閿?shù)字量輸入到處理器中；通過設(shè)置PINSEL1寄存器將引腳P0．26設(shè)置為AOUT功能，將模擬量輸入到光源驅(qū)動(dòng)電路用以保持光源亮度恒定；通過設(shè)置PINSEL0寄存器，配置P0．2、P0．3引腳為TXD0，RXD0功能，與MAX232連接，從而與上位機(jī)進(jìn)行通信．

2．3 步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路設(shè)計(jì)

針對(duì)不同的樣本，本系統(tǒng)中激發(fā)光路和發(fā)射光路中鏡片的選取及鏡片位置的改變，都需通過步進(jìn)電機(jī)來實(shí)現(xiàn)，而為了提高步進(jìn)的精度和改善步進(jìn)電機(jī)的低頻振動(dòng)，因此設(shè)計(jì)了步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路．

系統(tǒng)中使用兩片NJM3717驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)，使用LPC1768的P2端口、SN74ALVC16245將3．3 V電平轉(zhuǎn)換為5 V電平，之后再使用74 HC273與外接電阻組成的細(xì)分電路與NJM3717連接，從而驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)運(yùn)行。第一片的NJM3717的MB、MA引腳和第二片NJM3717的MB、MA引腳分別接步進(jìn)電機(jī)的兩相輸入輸出口，為其提供工作電流。本設(shè)計(jì)中選用57BYGH型步進(jìn)電機(jī)，其整步運(yùn)行時(shí)步距腳為1．8度，單步運(yùn)行時(shí)為0．9度，使用該細(xì)分電路32細(xì)分時(shí)經(jīng)過計(jì)算，步進(jìn)電機(jī)每一微步步進(jìn)距離的精度可以達(dá)到0．007 mm．該步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路的優(yōu)勢(shì)在于通過簡單的器件連接實(shí)現(xiàn)了步進(jìn)電機(jī)控制器的作用，節(jié)省了成本，同時(shí)有效地改善了步進(jìn)電機(jī)的動(dòng)態(tài)性能．

2．4 信號(hào)檢測電路設(shè)計(jì)

在本系統(tǒng)中信號(hào)檢測電路包括熒光信號(hào)檢測電路和激發(fā)光亮度采集電路．在熒光信號(hào)的檢測過程中，激發(fā)光強(qiáng)度必須保持恒定．

2．4．1 熒光信號(hào)檢測電路設(shè)計(jì)

在系統(tǒng)中，器件的選取以及熒光信號(hào)檢測電路設(shè)計(jì)的好壞，直接影響了系統(tǒng)最后的檢測結(jié)果，因此選用了濱松光子的H7712-12型光電倍增管，該光電倍增管有著180～900 nm的寬光譜效應(yīng)，電流-電壓轉(zhuǎn)換系數(shù)為0．1 V／μA，頻率帶寬為200 k Hz，并有著極好的輸出穩(wěn)定性．光電倍增管［8］將微弱的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為微弱的、頻率較高的電流信號(hào)，然后將電流信號(hào)濾波放大后變?yōu)殡妷盒盘?hào)經(jīng)A／D轉(zhuǎn)換器輸入到CPU去處理．其電路如圖2所示．光電倍增管輸出的電流信號(hào)接J1，經(jīng)濾波、I／V變換、放大后將電流信號(hào)變?yōu)殡妷盒盘?hào)O-A，將O-A輸入到A／D轉(zhuǎn)換器中變?yōu)閿?shù)字量用以微控制器處理．其中放大電路使用的是TLC274A，通過兩級(jí)放大后轉(zhuǎn)換為0～5 V的A／D轉(zhuǎn)換器可以使用的電壓信號(hào)．

圖2　熒光信號(hào)檢測電路Fig．2 The detection circuit of fluorescence signals

2．4．2 光源亮度采集電路

在檢測過程中，為了排除光源亮度的變化對(duì)檢測結(jié)果的影響，在整個(gè)檢測過程中要保持光源亮度不變，因此設(shè)計(jì)了光源亮度采集電路，通過亮度采集電路，將當(dāng)前光源強(qiáng)度值輸入到A／D轉(zhuǎn)換器中，采用PID控制和光源驅(qū)動(dòng)電路配合達(dá)到控制光源強(qiáng)度的目的，實(shí)現(xiàn)光源的亮度恒定．光源亮度的采集使用的是光電二極管，將光亮度的變化轉(zhuǎn)換為電流信號(hào)的變化．其電路如圖3所示．J1接光電二極管的輸出，濾波放大后變?yōu)殡妷盒盘?hào)O-B．其中放大器使用的是TLC274A．

2．5 通信電路設(shè)計(jì)

在該偏振檢測系統(tǒng)的檢測過程中，需要將下位機(jī)的數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)的傳輸?shù)缴衔粰C(jī)上，因此需要在上位機(jī)和下位機(jī)之間進(jìn)行通信，從而設(shè)計(jì)了串口通信電路。電路使用MAX232A將TTL電平轉(zhuǎn)換為RS232電平，MAX232A的11引腳和12引腳分別連接LPC1768的RXD0引腳和TXD0引腳，通過9腳端子連接到上位機(jī)的串行接口．

圖3　激發(fā)光亮度采集電路Fig．3 The acquisition circuit of excitation light intensity

3　系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

在軟件設(shè)計(jì)方面，LPC1768用的是C／C＋＋編譯器，能方便的在MDK下進(jìn)行程序的編寫和調(diào)試，減小了開發(fā)難度和開發(fā)周期，節(jié)約了開發(fā)成本．

針對(duì)系統(tǒng)的整體功能，軟件方面要能夠?qū)崿F(xiàn)系統(tǒng)的自檢、熒光偏振的檢測、數(shù)據(jù)的上傳等功能．

系統(tǒng)上電后首先對(duì)系統(tǒng)的存儲(chǔ)器、寄存器等進(jìn)行初始化，然后按照上位機(jī)的相關(guān)指令進(jìn)行系統(tǒng)自檢，以確保系統(tǒng)能夠進(jìn)行正常的工作．若系統(tǒng)自檢不正常，顯示錯(cuò)誤碼后結(jié)束；若系統(tǒng)自檢正常，按照相關(guān)指令調(diào)整試劑盤到檢測位置、打開光源、調(diào)整激發(fā)和發(fā)射濾光片、選擇垂直和水平偏振片、試劑盤退回等步驟后，完成熒光檢測，熒光檢測程序主要是得到熒光的垂直偏振強(qiáng)度M和水平偏振強(qiáng)度N，通過式（1）計(jì)算得到P值并返回到上位機(jī)［9］．根據(jù)P值的大小即可明確試劑的性質(zhì)．

4　系統(tǒng)性能測試及分析

4．1 統(tǒng)重復(fù)性誤差

實(shí)驗(yàn)方案：選擇2種熒光試劑，針對(duì)12種樣品進(jìn)行測試，重復(fù)性參數(shù)測試結(jié)果見表1．

測試方法是分別對(duì)A1～A7、A8～A12孔進(jìn)行重復(fù)測試，每隔1分鐘測試一次．根據(jù)

可計(jì)算出每組數(shù)據(jù)的的標(biāo)準(zhǔn)差和重復(fù)性誤差值，由表一可知系統(tǒng)重復(fù)性誤差（CV）小于3%，滿足性能要求．

表1　重復(fù)性測試數(shù)據(jù)Tab．1 Test data of repeatability

4．2 系統(tǒng)靈敏度

系統(tǒng)靈敏度測試：將所研發(fā)的熒光偏振檢測儀器檢測結(jié)果與國外同類儀器的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，檢測的陰陽性結(jié)果完全一致．結(jié)果見表2．

表2中偏振值P（P1、P2）的計(jì)算公式為P＝1 000*（M－G*N）／（M＋G*N），其中G為校正因子，取值為1．121．M為垂直偏振光強(qiáng)度，N為水平偏振光強(qiáng)度．其中M1、N1為國外對(duì)照儀器檢測的垂直和水平偏振光強(qiáng)度，M2、N2為研發(fā)的儀器檢測的垂直和水平偏振光強(qiáng)度，兩者陰陽性檢測結(jié)果相符合，對(duì)大于5個(gè)copies的樣品，陰陽性檢測測出正確率率可達(dá)到100%，滿足性能要求．

表2　靈敏度測試數(shù)據(jù)Tab．2 Test data of sensitivity

4．3 系統(tǒng)孔位測試不均勻性

測試方法：在E15～E22孔位放置同樣試劑，進(jìn)行重復(fù)檢測．檢測結(jié)果見表3．

系統(tǒng)經(jīng)過測試其重復(fù)性誤差、靈敏度和孔位不均勻性測試均滿足設(shè)計(jì)要求，并與進(jìn)口設(shè)備進(jìn)行雙熒光測試數(shù)據(jù)比較，檢測結(jié)果一致．

表3　孔位不均勻性測試數(shù)據(jù)Tab．3 Test data of holes unevenness

5　結(jié)論

針對(duì)基因、蛋白質(zhì)以及熒光標(biāo)示物標(biāo)識(shí)的有機(jī)物分子的存在檢測問題，研究了熒光的偏振原理，并設(shè)計(jì)了基于ARM的熒光偏振檢測系統(tǒng)．通過選取2種熒光試劑，12種樣品進(jìn)行了臨床試驗(yàn)與結(jié)果分析，結(jié)果表明該系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定，能夠同時(shí)進(jìn)行384個(gè)樣品的檢測，實(shí)現(xiàn)了多數(shù)量、多種樣品的檢測，而且檢測精度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，其重復(fù)性檢測誤差小于等于3%，正確性檢測測出正確率為100%，均滿足系統(tǒng)設(shè)計(jì)性能要求．

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（責(zé)任編輯、校對(duì) 張立新）

Detection System of Fluorescently Labeled Biological Molecules and Its Performance Analysis

NI Yuan1，LIU Kaitao1，NI Zhongchen2，ZHAO Yang1，WANG Hongjuan1，WEI Jing1
（1．School of Electronic Information Engineering，Xi’an Technological University，Xi’an 710021，China；2．Xi’an Qiyuan Mechanical and Electrical Equipment Co．，Ltd．，Xi’an 710018，China）

Abstract：In order to determine whether there is specific gene or protein in the sample，a fluorescent polarization system for detecting biomolecules was designed．This paper analyzes the disadvantages of the spectrophotometry and resonance light scattering analytical methods，deseribes the advantages and characteristics of the fluorescence polarization detection，studies the principle of fluorescence polarization detection system，and designs the optical path and the control system．A large number of biological testings were conducted with the new system．Experimental results show that the detection system is able to determine whether there is substance to be detected in the sample．The repeatability error is less than 3%，the accuracy rate is up to 100%and the unevenness of the holes test is less than 2%．

Key words：fluorescence；polarized light；detection system；biological molecules

作者簡介：倪 原（1955－），男，西安工業(yè)大學(xué)教授，主要研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)儀器．E-mail：ny930＠xatud．edu．cn．

*收稿日期：2015-04-23

DOI：10．16185／j．jxatu．edu．cn．2016．01．003

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：中圖號(hào)： TP216＋．3 A

文章編號(hào)：1673-9965（2016）01-0008-06