李　潔， 胡　進(jìn)， 馬力天，3， 葉　欣， 南巖東， 吳大方*

(1解放軍第451醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安　710054； 2解放軍68222部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)； 3第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院中醫(yī)科暨中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科； 4第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科； *通訊作者， E-mail：wudafangll@sohu.com；△共同通訊作者，E-mail：nanyandong2008@163.com

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S100A6基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定

李潔1， 胡進(jìn)2， 馬力天2，3， 葉欣1， 南巖東4△， 吳大方1*

(1解放軍第451醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安710054；2解放軍68222部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)；3第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院中醫(yī)科暨中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科；4第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；*通訊作者， E-mail：wudafangll@sohu.com；△共同通訊作者，E-mail：nanyandong2008@163.com

摘要：目的構(gòu)建S100A6基因重組慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)293T細(xì)胞包裝為重組慢病毒顆粒，并感染A549細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中高效、穩(wěn)定表達(dá)。方法PCR擴(kuò)增S100A6基因序列，將目的基因與酶切線性化載體pLenO-DCE定向連接，轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行DNA測(cè)序及比對(duì)。將構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒和輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞生產(chǎn)病毒液，熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因在293T細(xì)胞中的熒光表達(dá)，判斷重組慢病毒的感染效率。用得到的病毒液轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞，real-time PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后S100A6蛋白和S100A6 mRNA的表達(dá)。結(jié)果測(cè)序提示重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功；熒光顯微鏡觀察顯示在包裝細(xì)胞中獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。real-time PCR檢測(cè)顯示A549細(xì)胞中有S100A6 mRNA表達(dá)；Western blot顯示S100A6蛋白在A549細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建S100A6基因慢病毒表達(dá)載體，并成功感染A549細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中高效、穩(wěn)定表達(dá)，為S100A6基因功能及特性的研究和探索提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：慢病毒載體；A549細(xì)胞；S100A6基因

S100A6是S100蛋白家族中的一員，這些成員廣泛參與了細(xì)胞增殖、遷移、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等過(guò)程。S100A6可能參與了鈣離子的代謝，并作為鈣調(diào)蛋白的結(jié)合蛋白[1-4]。研究表明，S100A6蛋白的表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞中是上調(diào)的，比如胃癌[5,6]，甲狀腺癌[7]，肝癌[8]，乳腺癌[9]等。S100A6可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，尤其是在腫瘤細(xì)胞向周?chē)M織浸潤(rùn)的過(guò)程中[5,10]。本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建S100A6基因慢病毒載體，轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞后表達(dá)S100A6，為下一步分子機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

pLenO-DCE Vector(中國(guó)Invabio公司，cat.No.#26208-2)，DL2000 DNA ladder(日本Takara)，瓊脂糖(中國(guó)賽百盛公司)，BamHⅠ(Takara公司)，MscⅠ(美國(guó)NEB公司)，SmiⅠ(SwaⅠ)(Takara)，NucleoBond Xtra Midi Plus(德國(guó)MACHEREY-NAGEL公司)，AxyPrep質(zhì)粒小量制備試劑盒(美國(guó)Axygen公司)，制備感受態(tài)試劑盒(加拿大BIOSCIENCES)，包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞所)，大腸埃希菌DH5α(美國(guó)Invitrogen公司)，胎牛血清(美國(guó)PAA公司)，胰蛋白酶，A549人肺腺癌細(xì)胞系由Griad通過(guò)肺癌組織移植培養(yǎng)建系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)，熒光倒置顯微系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)，超高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，測(cè)序儀(Invitrogen公司)，穩(wěn)壓DNA電泳儀(美國(guó)BioRad公司)，凝膠成像儀(博迅儀器公司)。

1.2PCR擴(kuò)增S100A6

參考GenBank中S100A6的cDNA編碼序列(NM_014624)設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。S100A6上游引物序列：5′-ATGGCATGCCCCCTGGAT-3′；下游引物序列：5′-TCAGCCCTTGAGGGCTTC-3′。以含有S100A6基因的cDNA庫(kù)為模板，擴(kuò)增S100A6基因序列。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性2 min、98 ℃變性10 s、58 ℃退火30 s、68 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；68 ℃保溫5 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離產(chǎn)物，DNA凝膠回收試劑盒回收并純化S100A6片段。

1.3重組慢病毒質(zhì)粒pLenO-DCE-S100A6載體構(gòu)建

使用SmiⅠ對(duì)pLenO-DCE載體進(jìn)行酶切，使其線性化。反應(yīng)體系為：SmiⅠ(10 U/μl)1.5 μl，10×H Buffer 4.0 μl，BSA 0.4 μl，Plasmid DNA(500 ng/μl)15.0 μl，dH2O 19.1 μl；反應(yīng)條件：25 ℃，4 h。將酶切產(chǎn)物過(guò)柱純化，瓊脂糖凝膠電泳并分離產(chǎn)物。pLenO-DCE載體和S100A6基因酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)體系：pLenO-DCE載體DNA 1 μl，S100A6基因DNA片段1 μl，10×T4噬菌體DNA連接酶緩沖液1 μl，T4噬菌體DNA連接酶1 μl，dH2O 7 μl；反應(yīng)條件：16 ℃，12 h。

1.4重組子的篩選與鑒定

常規(guī)操作方法轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒方法抽提質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退化30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽(yáng)性克隆條帶。對(duì)陽(yáng)性pLenO-DCE-S100A6重組體使用BamH Ⅰ單切鑒定，反應(yīng)體系：BamH Ⅰ(10 U/μl)0.5 μl，MscⅠ 0.5 μl，10×Buffer 2.0 μl，BSA 0.2 μl，Plasmid DNA(500 ng/μl)8.0 μl，ddH2O 8.8 μl，總?cè)芤?0 μl；反應(yīng)條件：37 ℃，4 h。對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行DNA測(cè)序及比對(duì)。

1.5慢病毒顆粒包裝和濃縮

該慢病毒載體系統(tǒng)包括：pRsv-EV、pMDlg-pRRE、pMD2G、Transfer Vector，其中綠色熒光蛋白(GFP)被表達(dá)在慢病毒表達(dá)質(zhì)粒中，前3個(gè)為病毒包裝所必需。對(duì)這4種質(zhì)粒載體進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素的抽提。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，胰酶消化后接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(每個(gè)平皿接種細(xì)胞約為2×106-2.5×106)，置于37 ℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%-70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將各質(zhì)粒和磷酸鈣的混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)6-8 h后棄去該培養(yǎng)液，加入PBS 15 ml，輕搖后棄去，重復(fù)3次。更換培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞中加入含10 %FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml，培養(yǎng)48 h；收集轉(zhuǎn)染后72 h的293T細(xì)胞上清液，于4 ℃，4 000×g離心10 min，收集離心后的上清液，將上清液以0.45 μl濾器過(guò)濾；于40 ml超速離心管中，4 ℃，25 000 r/min離心2 h；而后以冰PBS液或DMEM重懸病毒沉淀，4 ℃溶解過(guò)夜。

1.6慢病毒的滴度測(cè)定

選用逐孔稀釋滴度測(cè)定法，首先293T細(xì)胞進(jìn)行鋪板，使用96孔板，每個(gè)孔中加1×105個(gè)細(xì)胞，體積為100 μl。準(zhǔn)備7-10個(gè)無(wú)菌EP管，在每個(gè)管中加入90 μl的新鮮培養(yǎng)基；向第一個(gè)管中加入待測(cè)定的病毒原液10 μl，混勻后，取10 μl加入到第二個(gè)管中。然后進(jìn)行相同的操作直到最后一管；選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 μl培養(yǎng)基并加入稀釋后的病毒溶液。培養(yǎng)24 h，加入新鮮培養(yǎng)基100 μl。繼續(xù)培養(yǎng)96 h，熒光顯微鏡觀察其生長(zhǎng)狀況，取0.1 μl pLenO-DCE-S100A6慢病毒感染的293T細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比率，并計(jì)算病毒滴度。

1.7病毒感染人肺腺癌A549細(xì)胞

將人肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含100 g/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A549細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合約60%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。共分為3組：空白對(duì)照組(NC組)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(GFP組)轉(zhuǎn)染只攜帶GFP而不攜帶目的基因的空載質(zhì)粒、目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(pLenO-DCE-S100A6組)轉(zhuǎn)染攜帶目的基因及GFP的質(zhì)粒。

1.8real-time PCR檢測(cè)A549細(xì)胞S100A6 mRNA表達(dá)

篩選后的細(xì)胞加入1 ml TRIzol，按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取RNA，測(cè)定總RNA的純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化PCR擴(kuò)增。S100A6上游引物：5′-ATGGCATGCCCCCTGGAT-3′，下游引物為：5′-TGAGGGCTTCATTGTAGATC-3′；β-actin上游引物為：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物為：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃保溫10 min，Bio-Rad CFX Manager 2.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.9Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞S100A6蛋白表達(dá)

以細(xì)胞裂解液裂解篩選后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白的濃度，灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗(博士德，PB0716)(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，化學(xué)熒光發(fā)光法顯色。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組間S100A6相對(duì)表達(dá)量采用Studentt檢驗(yàn)分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增S100A6基因

PCR成功擴(kuò)增出S100A6序列DNA片段，電泳可見(jiàn)大小約250 bp的特異性條帶(見(jiàn)圖1)。

圖1　PCR擴(kuò)增S100A6基因產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Figure 1　Gel electrophoresis of the PCR product

2.2重組質(zhì)粒pLenO-DCE-S100A6 PCR擴(kuò)增鑒定

pLenO-DCE-S100A6重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，得到大小約270 bp陽(yáng)性克隆(見(jiàn)圖2)。

1，2，4-6，8.pLenO-DCE-S100A6；3.陰性對(duì)照(ddH2O)； 7.空載體對(duì)照(pLenO-DCE)；9.陽(yáng)性對(duì)照(GAPDH)；M.Marker圖2　pLenO-DCE-S100A6重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析Figure 2　Gel electrophoresis analysis of the PCR products of recombinant plasmid

2.3pLenO-DCE-S100A6陽(yáng)性克隆測(cè)序

pLenO-DCE-S100A6的陽(yáng)性克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與克隆模板序列比對(duì)完全一致(圖3)。

2.4慢病毒制備及滴度測(cè)定

pLenO-DCE-S100A6共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24 h，熒光顯微鏡觀察示細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，48 h細(xì)胞內(nèi)綠色激發(fā)熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)。取0.1 μl pLenO-DCE-S100A6慢病毒感染的293T細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比率，計(jì)算得出病毒滴度為2.1×109TU/ml。

2.5A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后S100A6 mRNA表達(dá)

real-time PCR檢測(cè)顯示，pLenO-DCE-S100A6組較NC組和GFP組具有更高的S100A6 mRNA的表達(dá)；pLenO-DCE-S100A6組與NC組和GFP組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而NC組和GFP組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3　pLenO-DCE-S100A6陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果(第1-100堿基序列)Figure 3　The pLenO-DCE-S100A6 sequencing of the positive clones (bases sequence from 1 to 100)

圖4　pLenO-DCE-S100A6慢病毒感染的293T細(xì)胞熒光表達(dá)檢測(cè) (×100)Figure 4　GFP expression in 293T cells 24 h and 48 h after infection (fluorescent microscope×100)

與NC組比較，*P<0.01；與GFP組比較，#P<0.01圖5　A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后S100A6 mRNA表達(dá)結(jié)果Figure 5　The mRNA expression of S100A6 gene in A549 cells

2.6A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后S100A6蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示pLenO-DCE-S100A6組較NC組和GFP組具有更高的S100A6 蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖6)。

3討論

S100A6為S100蛋白家族成員之一，可能參與了鈣離子的代謝[11]，并與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、增殖等活動(dòng)相關(guān)[9,12]。S100A6在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，可以通過(guò)影響鈣離子和一些信號(hào)通路如Wnt/β-Catenin等來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞[9]。

圖6　A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后S100A6蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 6　The protein expression of S100A6 gene in A549 cells by Western blot

化療是治療腫瘤的重要手段，其主要作用在于抑制原發(fā)病灶的復(fù)燃和癌癥的轉(zhuǎn)移。然而，由于多重耐藥(multiple drug resistance，MDR)的產(chǎn)生，使化療效果大打折扣，達(dá)不到預(yù)期的效果。因此深入研究腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制十分重要。有研究表明[13]，S100A6與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)，在胃癌細(xì)胞中，S100A6的低表達(dá)會(huì)使胃癌細(xì)胞的耐藥性上升。S100A6與腫瘤細(xì)胞耐藥性的關(guān)系極為復(fù)雜，與Ca2+關(guān)系較為密切[14]，低表達(dá)的S100A6蛋白會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，解除對(duì)MDR1的抑制，MDR1基因能編碼一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，該蛋白具有泵的作用，可以將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出到細(xì)胞外，是MDR發(fā)生的重要機(jī)制[15]。

經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系[16]，異常激活的Wnt信號(hào)通路導(dǎo)致beta-Catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。S100A6與Wnt信號(hào)通路有著密切的聯(lián)系，在多種腫瘤細(xì)胞中，高表達(dá)的S100A6和beta-Catenin常同時(shí)存在[17]，S100A6可以直接與beta-Catenin相互作用，抑制beta-Catenin降解，這可能是導(dǎo)致beta-Catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量聚集的原因之一[18]。此外，S100A6在鈣周期素結(jié)合蛋白(CacyBP/SIP)核轉(zhuǎn)位的調(diào)節(jié)中起重要作用[19]，CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[20]，高表達(dá)的S100A6可以與CacyBP/SIP結(jié)合，調(diào)節(jié)CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21]。

慢病毒作為載體可提高轉(zhuǎn)染效率，可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因釣取方法從基因文庫(kù)中獲取S100A6基因，成功構(gòu)建S100A6基因慢病毒載體，并成功地轉(zhuǎn)染了A549細(xì)胞，為后續(xù)分子生物學(xué)研究提供參考。

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Construction, transfection and identification of S100A6-gene-overexpressed lentivirus vector

LI Jie1, HU Jin2, MA Litian2，3, YE Xin1, NAN Yandong4△, WU Dafang1*

(1DepartmentofEndocrinology, 451thHospitalofPeople’sLiberationArmy,Xi’an710054,China;2MedicalCropsof68222ofPLA;3DepartmentIntegratedTraditionalandWesternMedicineofOncology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;4DepartmentofRespiratoryDiseaseandCriticalCareUnit,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity:*Correspondingauthor,E-mail:wudafangll@sohu.com；△Co-correspondingauthor,E-mail:nanyandong2008@163.com)

Abstract：ObjectiveTo construct the S100A6-gene-overexpressed lentivirus vector and investigate the expression of S100A6 in human lung adenocarcinoma cell line A549 after transfection. MethodsThe sequence of S100A6 was amplified by PCR，and then subcloned into pLenO-DCE vector with infusion technique to generate pLenO-DCE-S100A6. The PCR products of recombinant plasmid were analyzed by gel electrophoresis and the positive clones were confirmed by sequencing. After the cotransfection of pLenO-DCE-S100A6, green fluorescent protein(GFP) expression was observed to evaluate the gene delivery efficiency in 293T cells. Finally, the virus produced by 293T cells was transfected into A549 cells. S100A6 protein and mRNA expression in A549 cells was detected by Western blot and real-time PCR. ResultsDNA sequencing confirmed that the recombinant lentivirus plasmid was successfully constructed.Recombinant lentiviruses were successfully produced in 293T cells. The expression of S100A6 and S100A6 mRNA were successfully detected in A549 cells.ConclusionThe recombinant lentivirus plasmid is successfully constructed and S100A6 is expressed in A549 cells stably，which establishes the basis on the further molecular function study of S100A6.

Key words:lentiviral vector;A549 cell;S100A6 gene

[收稿日期：2015-09-21]

作者簡(jiǎn)介：李潔，女，1978-09生，碩士，主治醫(yī)師.

中圖分類號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)02-0127-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.02.006

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81001040);第四軍醫(yī)大學(xué)優(yōu)秀文職人員基金資助項(xiàng)目(2011-01);第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院后備人才基金資助項(xiàng)目(5033)