王　琳，王　希，董　軻，張惠中

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床實驗與檢驗科，陜西西安 710038)

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·論著·

Trop2病毒樣顆粒的制備及純化研究*

王琳，王希，董軻，張惠中△

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床實驗與檢驗科，陜西西安 710038)

摘要:目的獲得Trop2為靶點的病毒樣顆粒(VLPs)，為進一步體內(nèi)誘導實驗和疫苗研究提供依據(jù)。方法利用分子克隆技術構(gòu)建Trop2真核表達載體pCAGGs/Trop2和桿狀病毒表達載體pFastbac1/Trop2，以pCAGGs/Trop2表達載體轉(zhuǎn)化Hela細胞，用免疫細胞化學方法確定Trop2蛋白表達并錨定于胞膜上；以pFastbac1/Trop2轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH10bac菌株獲得重組桿粒Trop2 Bacmid，轉(zhuǎn)染Tn5昆蟲細胞獲得重組病毒Trop2 rBV，與本室保存的Gag rBV共感染昆蟲細胞得到重組VLPs，透析濃縮后經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化、蛋白免疫印跡(WB)鑒定，電鏡觀察病毒形態(tài)。結(jié)果構(gòu)建成功的重組桿粒Trop2 Bacmid轉(zhuǎn)染Tn5昆蟲細胞獲得重組病毒Trop2 rBV，與Gag rBV共感染昆蟲細胞獲得重組Trop2 VLPs。結(jié)論成功制備了Trop2 VLPs，為其后續(xù)誘導體液和細胞免疫應答研究奠定了基礎。

關鍵詞:Trop2；腫瘤疫苗；病毒樣顆粒

隨著分子生物學、細胞生物學和免疫學等研究的進展，腫瘤疫苗逐漸成為腫瘤免疫治療的熱點，但目前研發(fā)的臨床實驗腫瘤疫苗很難獲得滿意療效，新型更有效的腫瘤疫苗制備策略亟待發(fā)掘[1]。病毒樣顆粒(VLPs)是由病毒單一或多個結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配形成，能夠模擬天然病毒衣殼空間結(jié)構(gòu)[2]，因VLPs不含病毒的核酸成分而無復制和感染能力，但具有天然病毒的類似嗜性，能被多種免疫細胞攝取并在細胞內(nèi)運輸，從而通過主要組織相容性復合體(MHCⅠ)類途徑呈遞，激發(fā)全面免疫反應，這些獨特的性質(zhì)使VLPs在疫苗研究中備受關注，為新型疫苗的研發(fā)提供了新平臺；膜表面糖蛋白Trop2高表達于多種上皮來源的惡性腫瘤[3]，并與肺癌惡性程度密切相關[4]，其表達產(chǎn)物定位于細胞膜表面，使其成為抗體和ADCC的理想作用靶點[5]；VLPs自我裝配過程中，外源蛋白與殼蛋白Gag之間會有相互作用關系，外源蛋白之間的相互作用也會影響VLPs組裝效率及蛋白呈現(xiàn)特性[6-8]。本課題擬結(jié)合SIV-Gag病毒制備特點制備以Trop2 為靶點的VLPs，為后續(xù)體內(nèi)免疫應答實驗及有效的新型腫瘤疫苗研究提供依據(jù)，為高表達Trop2的惡性腫瘤如肺癌、宮頸癌、胃癌及胰腺癌疫苗研制與應用提供新思路和借鑒依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1菌株、細胞株及質(zhì)粒大腸桿菌E.coliJM109、E.coliDH5a、E.coliDH10bac、人宮頸癌細胞株Hela和昆蟲細胞Tn5，桿狀病毒表達載體pFastBac1、真核表達載體pCAGGs均為本實驗室保存，SIV-Gag桿狀病毒(rBV-Gag)為美國Emory大學Ling Ye教授惠贈。

1.1.2主要試劑與儀器CellfectinⅡReagent、Sf-900ⅡSFM、Unsupplemented Grace′s Insect Medium、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；QSM-O3SP/50蛋白質(zhì)濃縮儀購自美國通用；Hitachi-H7500透射電鏡由唐都醫(yī)院電鏡中心提供；分子克隆載體及相關輔助試劑、各種酶、抗菌藥物、IPTG、X-gal均購自于TaKaRa公司；引物由北京奧科鼎盛生物科技公司合成。

1.2方法

1.2.1Trop2基因擴增根據(jù)Gene Bank Trop2序列設計引物，分別從不同新生鼠組織用Trizol法提取相應RNA，RT-PCR擴增出Trop2基因序列、回收PCR產(chǎn)物，按照克隆載體pMDTM18-Vector說明書進行連接反應，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)，涂布LB/Amp培養(yǎng)平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，隨機挑取單菌落增菌并提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后送測序，得到含有目的基因的T克隆載體Tv/Trop2。

1.2.2Trop2真核表達載體的構(gòu)建用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切測序成功的Tv/Trop2和真核表達載體pCAGGs，PCR回收目的片段連接到pCAGGs上，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定成功，構(gòu)建真核表達載體并命名為pC/Trop2。

1.2.3Trop2包膜定位表達確認真核表達載體pC/Trop2參照脂質(zhì)體Lipofectamine2000說明書轉(zhuǎn)染Hela細胞，分別設立空白對照組、陰性對照組。轉(zhuǎn)染24 h后RIPA細胞裂解液裂解細胞，收集標本，常規(guī)方法進行Western Blot檢測Trop2蛋白表達；同時，Hela細胞爬片、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后24 h，取出爬片進行細胞免疫化學染色，檢測Trop2蛋白在細胞水平的表達情況。

1.2.4Trop2桿狀病毒表達載體的構(gòu)建用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒Tv/Trop2和pFastBac1桿狀病毒表達載體，回收后用T4連接酶連接目的片段與載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細胞，涂布LB/Amp培養(yǎng)平板，37 ℃過夜培養(yǎng)；隨機挑取單菌落增菌并提取質(zhì)粒DNA，雙酶切及測序鑒定正確后，得到桿狀病毒表達載體命名為pF/Trop2。

1.2.5pF/Trop2轉(zhuǎn)染與Bacmid鑒定將1 μL pF/Trop2桿狀病毒表達載體轉(zhuǎn)染100 μL E.coliDH10bac感受態(tài)細胞，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，加入900 μL LB培養(yǎng)基、37 ℃、180 r/min培養(yǎng)4 h，篩選培養(yǎng)板(含100 μg/mL X-gal、40 μg/mL IPTG、50 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL四環(huán)素、7 μg/mL慶大霉素)37 ℃培養(yǎng)48 h，藍白篩選陽性克隆，參照S.N.A.P MidiPrep Kit說明書分離重組桿粒DNA(Bacmid)，用pUC/M13鑒定引物進行PCR鑒定，并命名為Trop2 Bacmid。

1.2.6Bacmid轉(zhuǎn)染TN5昆蟲細胞制備Rbv 1 μL Trop2-bacmid 與10 μL轉(zhuǎn)染試劑混合，依據(jù) CellfectinⅡReagent說明書操作轉(zhuǎn)染Tn5昆蟲細胞，27 ℃培養(yǎng)6 h，更換Sf-900ⅡSFM繼續(xù)培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象表明桿粒轉(zhuǎn)染成功，收集上清液獲得第一代病毒P1，傳代擴增病毒進行滴度測定，至滴度達到(5×107～108)pfu/mL，收集病毒命名為Trop2 rBV。

1.2.7Trop2 VLPs制備與純化以Gag rBV(本室保存)和Trop2 rBV MOI比例為1∶10共感染TN5昆蟲細胞，感染72 h后收集培養(yǎng)上清液，經(jīng)QSM-O3SP/50蛋白質(zhì)濃縮儀濃縮后，蔗糖梯度密度離心(從管口至管底質(zhì)量/體積百分比濃度梯度依次為10%、>10%～30%、>30%～50%)，從管底依次收集不同片段，無鈣鎂PBS洗滌純化。

1.2.8蛋白免疫印跡鑒定表達以SDS-PAGE及蛋白免疫印跡法分別檢測收集片段的目的蛋白表達，依據(jù)常規(guī)方法進行，將上述標本跑SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色；同時SDS-PAGE膠上目的蛋白用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別用SIV-Gag和Trop2抗體檢測目的蛋白表達。

1.2.9電鏡觀察取制備好的Trop2 VLPs ，滴一小滴于銅網(wǎng)上，使有支持膜的表面與樣品液表面接觸，稍晾干，1%磷鎢酸溶液負染晾干后，Hitachi-H7500透射電鏡觀察制備好的VLPs形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果

2.1構(gòu)建Trop2真核表達載體、桿狀病毒表達載體及包膜定位表達情況新生鼠組織(肌肉、小腸、腎臟、肺臟、心臟、肝臟及腦)中提取的RNA，RT-PCR法擴增Trop2基因，結(jié)果顯示在肌肉、腎臟中擴增出970 bp目的條帶，連接T克隆載體、EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定大小正確，DNA測序結(jié)果比對，獲得測序正確的Tv/mTrop2目的基因，見圖1。

1～7：不同鼠組織Trop2 PCR產(chǎn)物；M：DL2000 Marker。

圖1Trop2基因RT-PCR結(jié)果

目的基因克隆入pCAGGs真核表達載體(4 790 bp)和pFastbac1桿狀病毒表達載體(4 750 bp)，EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果顯示目的片段970 bp，條帶大小正確，見圖2，測序結(jié)果經(jīng)比對與目的基因Trop2一致，成功構(gòu)建了真核表達載體pC/Trop2和桿狀病毒表達載體pF/Trop2。

1：pC/Trop2真核表達載體;2：pF/Trop2桿狀病毒表達載體;M：DL2000 Marker。

圖2pC/Trop2、pF/Trop2載體酶切鑒定

1：空白組;2：轉(zhuǎn)染pCAGGs陰性對照組;3：轉(zhuǎn)染 pC/Trop2表達載體組;M：DL2000 Marker。

圖3WB檢測Trop2表達

蛋白免疫印跡鑒定Trop2在Hela細胞表達情況，結(jié)果顯示，對比分析空白對照、陰性對照顯示約在35×103處出現(xiàn)特異條帶，見圖3，證實轉(zhuǎn)染了pC/Trop2表達載體的Hela細胞成功表達Trop2蛋白。細胞免疫化學方法結(jié)果顯示對比NC組可見Trop2組在細胞膜高表達，見圖4，證實表達產(chǎn)物錨定于胞膜。

NC：轉(zhuǎn)染pCAGGS陰性對照組;Trop2：轉(zhuǎn)染pC/Trop2真核表達載體組。

圖4免疫組化檢測Trop2真核表達定位

2.2Trop2 Bacmid鑒定結(jié)果桿狀病毒表達載體pF/Trop2轉(zhuǎn)座E.coliDH10bac菌株，白色克隆為陽性克隆，應用鑒定引物(pUC/M13)進行PCR鑒定、分離桿粒，顯示1#、2#擴增出目的片段3 270 bp(2 300 bp+970 bp)和陽性對照片段(2 900 bp)，證實目的基因已整合入桿粒，命名為Trop2 Bacmid，見圖5。

1#、2#：1號、2號Trop2 BacmidPCR產(chǎn)物；positive：陽性對照；M：DL15000 Marker。

圖5Trop2 Bacmid鑒定結(jié)果

2.3嵌合Trop2 VLPs的制備與鑒定Trop2 Bacmid轉(zhuǎn)染細胞5 d后，細胞逐漸增大、腫脹，漸脫離貼壁培養(yǎng)狀態(tài)，對比正常對照組、轉(zhuǎn)染組結(jié)果表明桿粒轉(zhuǎn)染成功,見圖6。上清傳代擴增培養(yǎng)，按照Gag rBV與Trop2 rBV MOI比例1∶10共感染TN5細胞大量制備VLPs，濃縮純化收集不同密度層蛋白片段，蛋白免疫印跡分析VLPs純度，分析結(jié)果可見洗脫后在30%～50%蔗糖濃度層VLPs片段含量最大，見圖7。

A：未轉(zhuǎn)染組；B：轉(zhuǎn)染Trop2 Bacmid組。

圖6轉(zhuǎn)染TN 5細胞后

1：10%蔗糖濃度層VLPs;2：>10%～30%蔗糖濃度層VLPs;3:>30%～50%蔗糖濃度層VLPs。

圖7WB檢測VLPs 組裝效率

2.4電鏡觀察透射電鏡負染結(jié)果表明視野中出現(xiàn)結(jié)構(gòu)完整、顆粒大小均一的VLPs，其直徑大小為110～120 nm 與gag VLPs直徑大小相似(直徑大小約110 nm)，表明該方法能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)完整的VLPs，見圖8。

圖8　　透射電鏡觀察VLPs

3討論

肺癌是當前世界上發(fā)病率較高的惡性腫瘤，隨著免疫治療研究的不斷深入，以腫瘤特異性抗原為基礎的疫苗研究備受關注[9]，VLPs疫苗研發(fā)技術成為腫瘤疫苗研發(fā)的新策略之一，為腫瘤的預防和治療開辟了新的途徑。

膜表面糖蛋白Trop2在多種上皮來源的惡性腫瘤中過表達，在腫瘤細胞増殖及決定惡性表型中發(fā)揮重要作用，定位于胞膜表面使其成為抗體和抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)的理想靶點，尤其是對那些缺乏有效表達MHC Ⅰ類分子而不能呈遞抗原于細胞毒T細胞的腫瘤細胞具有更重要的抗原遞呈意義[10]。VLPs因抗原呈現(xiàn)好、制備簡便安全性高、免疫原性強等優(yōu)勢，成為疫苗研發(fā)熱點。

本課題中結(jié)合SIV-Gag在病毒復制過程中的裝配機制特性，制備以Trop2為靶點的嵌合型肺癌VLPs?？紤]到VLPs自我裝配過程中，外源蛋白需通過與殼蛋白Gag之間相互作用出胞并形成VLP，外源蛋白胞內(nèi)表達定位直接影響VLPs組裝效率及蛋白呈現(xiàn)特性[11]，首先通過構(gòu)建真核表達載體pC/Trop2在Hela細胞中表達，經(jīng)免疫細胞化學法確定了Trop2蛋白表達并定位在細胞膜上，使抗原成分有利于呈現(xiàn)于VLPs結(jié)構(gòu)表面；其次，有多種系統(tǒng)可用于VLPs表達制備，選擇Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)表達并獲得Trop2靶抗原組裝的VLPs。其優(yōu)點如下：表達量較高、細胞培養(yǎng)方便、桿狀病毒使用相對安全，應用廣泛，可以在一個細胞中表達多種蛋白[12]。除此之外，本研究結(jié)合SIVGag蛋白和Trop2rBV共感染制備嵌合VLPs，多種MOI比例共感染昆蟲細胞制備嵌合VLPs，進行體外生物學活性鑒定，篩選最有效的比例可以優(yōu)化VLPs組裝效率，從而為后續(xù)的體內(nèi)實驗及有效的新型肺癌疫苗研究提供依據(jù)，也為高表達Trop2的其他惡性腫瘤如宮頸癌、胃癌及胰腺癌的疫苗研制提供新思路和借鑒依據(jù)[13]。

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Expression and purification of Trop2 virus like particles*

WangLin,WangXi,DongKe，ZhangHuizhong△

(DepartmentofClinicalResearchandDiagnaosis,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an，Shaanxi710038，China)

Abstract:ObjectiveTo gain the virus like particles (VLPs) based on Trop2 targets,which provided the basis for further in vivo induced experiments and anti-tumor vaccine studies.MethodsUsing molecular cloning method to constract eukaryotic expression vector of pCAGGs/Trop2 and baculovirus expression vector of pFastbac1/Trop2,expression product of pCAGGs/Trop2 in HeLa cells were intended to be to be anchored to the cell membrane by the methods of Immunohistochemistry;pFastbac1/Trop2 were transformed into E.coliDH10bac isolates to gain recombinant bacmids,which were transfected into insect cells to express recombinant baculovirus with Gag rBV,then sucrose density gradient centrifugation，Western Blot and electron microscope were performed to purify and identify the Trop2 VLPs.ResultsBuilding recombinant bacmids which were transfected into insect cells to express recombinant baculovirus with Gag rBV,gained the recombinant Virus like Particles.ConclusionTrop2 VLPs was successfully prepared,which laid the foundation for the subsequent induction of humoral and cellular immune response.

Key words:Trop2；tumor vaccine；virus like particles

(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.002

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1020-04

基金項目：國家自然科學基金(81201775、81572974)；陜西省自然科學基礎研究計劃(2013JZ010)。

作者簡介：王琳，女，檢驗技師，主要從事醫(yī)學分子生物學方面的研究。△通訊作者，E-mail：huizz328@163.com。