王曉環(huán)，康　頔，王德飄，吳玉娥，曾　松，張侃侃，胡德禹

(貴州大學 精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

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大豆中硝磺草酮的殘留量測定

王曉環(huán)，康頔，王德飄，吳玉娥，曾松，張侃侃*，胡德禹

(貴州大學 精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

摘要:為快速檢測大豆中硝磺草酮殘留量建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜的新方法。大豆樣品采用乙腈提取，NaCl鹽析，十八 (烷)基硅烷 (C18)和石墨化炭黑 (GCB)分散固相萃取凈化，以phenomenex Luna 3u C18(2) 100A柱為分離柱，用乙腈和0.1%氨水溶液進行梯度洗脫，電噴霧負離子 (ESI-)多反應監(jiān)測，高效液相色譜-串聯(lián)質譜 (HPLC-MS/MS)測定。本方法條件下，硝磺草酮在0.0075-0.75 μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系 (R2>0.997)，方法檢出限 (LOD)和定量限 (LOQ)分別為0.0009和0.003 mg/kg。在0.003、0.03和0.3 mg/kg添加水平下，硝磺草酮的日內平均回收率為83.84-96.24%，日內相對標準偏差 (RSD)為1.99-3.78%，日間平均回收率為85.13-95.25%，日間RSD為2.11-3.47%，能滿足大豆中硝磺草酮檢測的要求。

關鍵詞：硝磺草酮；大豆；QuEChERS法；高效液相色譜—串聯(lián)質譜法

大豆是全世界種植面積最廣的油料作物。來自美國農業(yè)部的數據表明，2013-2014年的全球大豆產量達2839.5億公噸[1-2]。由于富含豐富的蛋白質、脂肪、維生素、礦物質和纖維素，大豆能被制備成各種豆制品。然而，豆田中雜草眾多致使大豆產量受到嚴重影響，除草就顯得至關重要。

硝磺草酮 (mesotrione)，化學名2-(4-甲磺?；?2-硝基苯甲酰基)環(huán)己烷-1,3-二酮，又名甲基磺草酮，是瑞士先正達公司開發(fā)的芽前和苗后廣譜選擇性的新型三酮類除草劑。通過抑制對羥苯基丙酮酸雙加氧酶的活性而抑制植物類胡蘿卜素和葉綠素的合成，使植物產生白化癥狀而緩慢死亡[3-5]。但最近研究發(fā)現(xiàn)，由于硝磺草酮高效的起始活性和殘留活性，長期食用含有硝磺草酮殘留的食物有致癌和致畸的風險[6-7]。2015年國際食品法典委員會 (CAC)規(guī)定硝磺草酮在大豆上的最大殘留限量值 (MRL)為0.03 mg/kg[8]。

硝磺草酮是難揮發(fā)性化合物，對熱不穩(wěn)定，無法進行氣相色譜分析。目前，硝磺草酮在多種基質上的殘留分析都有報道，檢測的方法主要是高效液相色譜法[9-13]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-18]，硝磺草酮在大豆上殘留分析方法未見報道。本研究參考QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)方法，對硝磺草酮在大豆上的前處理方法進行了優(yōu)化改進，通過高效液相色譜-串聯(lián)質譜法 (HPLC-MS/MS)檢測，建立了簡單、快速、準確的殘留分析方法。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1儀器

LC-20AD-XR高效液相色譜儀 (日本島津公司)和4000 QTRAP三重四極桿質譜儀 (美國AB SCIEX公司)，配電噴霧離子源 (ESI)；TGL-10B型離心機 (上海安亭科學儀器廠)；BUCHI R-210型旋轉蒸發(fā)儀 (瑞士BUCHI公司)；QL-901型渦旋混合器 (江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)。

1.1.2試劑

硝磺草酮標準品 (純度≥99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司)；質譜乙腈、色譜甲酸和色譜氨水均購置于美國Fisher Scientific公司；純凈水 (屈臣氏集團 (香港)有限公司)；尼龍濾膜 (0.22 μm，美國Millipore公司)；N-丙基乙二胺 (PSA)，十八 (烷)基硅烷 (C18)和石墨化炭黑 (GCB)均為分析純，購于天津博納艾杰爾科技有限公司。

大豆樣品來源于貴州、江西、黑龍江和浙江4省的抽樣調查，每個省設置10個不同的抽樣地點，主要是菜市場、農貿市場和超市。將大豆樣品用粉碎機粉碎，分裝好以待測樣。

1.2方法

1.2.1標準溶液的配制

準確稱取0.0200 g (精確至0.0001 g)硝磺草酮標準樣品于100 mL容量瓶中，用色譜乙腈溶解并定容，配置成200 μg/mL的標準儲備液。再逐級稀釋成所需系列的標準工作溶液，-20℃避光保存。

1.2.2樣品前處理

稱取5.0 g (精確至0.1 g)處理好的大豆樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入20 mL乙腈渦旋提取1 min，加入1 g NaCl，渦旋1 min，6000 rpm/min條件下離心5 min。取10 mL上清液于50 mL梨形瓶中并在45℃旋轉濃縮蒸發(fā)至近干。1 mL色譜乙腈再溶解，轉移至裝有30 mg GCB 和20 mg C18的2 mL離心管中，渦旋30 s，然后在10000 rpm/min 條件下離心3 min。上清液過0.22 μm濾膜，HPLCMS/MS檢測。

1.3分析條件

1.3.1液相色譜條件

液相色譜柱：Luna 3u C18(2) 100A色譜柱 (150×3.0 mm，美國Phenomenex公司)；柱溫：40℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：A為乙腈溶液，B為0.1%氨水溶液 (v/v)；梯度洗脫條件：0-3.0 min，保持5%A+95%B；3.0-3.5 min，5%A+95%B變?yōu)?0%A+20%B；3.5-6.0 min，保持80%A+20%B；6.0-6.5 min，80%A+20%B變?yōu)?%A+95%B；6.5-9.0 min，保持5%A+95%B。

1.3.2質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源，負離子模式 (ESI-)質譜掃描方式；多反應監(jiān)測 (MRM)；氣簾氣壓力：25 kPa；離子噴霧電壓：-4500 V；輔助氣壓1 (N2)：50 kPa；輔助氣壓2 (N2)：50 kPa；離子源溫度：600℃。硝磺草酮的檢測離子、去簇電壓和碰撞電壓等質譜參數如表1所示。

表1　硝磺草酮的串聯(lián)質譜測定參數

注：*定量離子 。

2結果與分析

2.1液相色譜條件的優(yōu)化

電噴霧質譜的電離是在溶液狀態(tài)電離，流動相的組成會影響到目標化合物的峰形和離子化效率，進而影響靈敏度[19]。本試驗研究了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸 (v/v)和乙腈-0.1%氨水 (v/v)3種流動相體系，結果表明，在ESI-電離模式下，0.1%氨水溶液有利于硝磺草酮離子化，提高硝磺草酮的響應值。然后，對比了流動相乙腈-5%，50%和95%氨水溶液對色譜峰面積的影響。結果表明，隨著氨水含量增加，峰面積逐漸增大，響應增強。因此，最終確定乙腈-95%氨水溶液作為流動相 (圖1)。

圖1　流動相對目標化合物色譜峰面積的影響

(A：乙腈∶水=50∶50；B：乙腈∶0.1%甲酸=50∶50；C：乙腈∶0.1%氨水=95∶5；D：乙腈∶0.1%氨水=50∶50；E：乙腈∶0.1%氨水=5∶95，體積比)

2.2樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化

提取溶劑在前處理過程中是一個重要的影響因素，本試驗根據不同溶劑的物理化學特性，比較了甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷和乙腈的提取效果。結果表明，隨著硝磺草酮在不同溶劑中溶解度的增大，回收率依次增大，分別為2.97、57.19、62.85、72.07和93.51%。因此，選擇乙腈作為最佳提取溶劑 (圖2)。

2.2.2提取溶劑用量和提取時間的優(yōu)化

試驗考察了乙腈用量 (10、20和30 mL)對回收率的影響。結果表明，隨著溶劑量增大，回收率也逐漸增大。然而，當提取溶劑為20和30 mL時，回收率沒有顯著差別。因此，為了節(jié)省溶劑，選擇20 mL作為最佳提取溶劑。提取時間也是影響回收率的重要因素，在該項研究中，對比了1、2、3和4 min的提取效果。大豆富含油脂和蛋白，是一種復雜的基質，如果渦旋時間太長，會提取出更多的雜質。由圖3可知，提取溶劑為20 mL時，渦旋2和3 min時的回收率差別不大，渦旋4 min時回收率反而降低。因此，為了兼顧回收率、節(jié)約時間和盡量減小基質干擾，選擇2 min作為最佳提取時間。

圖2　提取劑對大豆中硝磺草酮回收率的影響

圖3　提取劑用量和提取時間對大豆中硝磺草酮

2.2.3吸附劑的優(yōu)化

目前，QuEChERS常用的吸附劑主要有PSA、C18和GCB。C18比較適合去除脂類等疏水性雜質；PSA是一種弱陰離子交換劑，主要用于去除脂肪酸，但干擾物在ESI負離子模式下會對目標物產生嚴重的離子抑制現(xiàn)象；GCB主要用于去除色素類物質，對于芳香族化合物具有較強的去除能力[20]。在該項研究中，分別考察了10、20、30、40和50 mg 的PSA、C18或GCB 對回收率的影響。發(fā)現(xiàn)經PSA、C18和GCB凈化后的回收率分別為1.49-12.32%，80.97-104.19%和93.23-99.68%。表明PSA作為吸附劑時，硝磺草酮的質譜響應被抑制。因此，20 mg C18和30 mg GCB作為吸附劑是去除干擾物、保證靈敏度的最佳選擇 (圖4)。

圖4　不同吸附劑對大豆中硝磺草酮

2.3基質效應的考察

基質效應 (ME)通過以下公式進行計算[21-22]：

m基質和m溶劑分別為目標物基質標準曲線的斜率和溶劑標準曲線的斜率。ME為零時表明沒有基質效應存在，ME為正值時表明存在基質增強效應，ME為負值時表明存在基質減弱效應。

按照優(yōu)化的前處理方法制備大豆基質標準溶液，在優(yōu)化的色譜條件下進行分析檢測并繪制出溶劑標準曲線和基質標準曲線，線性方程分別為y= 11431953x+ 123565 (R2= 0.9975)和y= 13525586x+ 88645 (R2= 0.9994)。計算得ME = 0.18，表明硝磺草酮在大豆中存在基質增強效應。因此，為了確保結果的準確性，在實際樣品檢測過程中，采用基質標準曲線進行定量分析。

2.4方法確證

2.4.1線性關系、檢出限和定量限

以基質標準溶液濃度為橫坐標，硝磺草酮定量離子的色譜峰峰面積為縱坐標，繪制基質標準曲線。結果表明，硝磺草酮在0.0075-0.75 μg/mL的濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數>0.999。方法的檢出限 (LOD，S/N=3)和定量限 (LOQ，S/N=10)分別為0.0009和0.003 mg/kg，能夠滿足大豆中硝磺草酮的殘留檢測。

2.4.2準確度和精密度

用空白大豆樣品進行加標回收率實驗，分別在0.003、0.03和0.3 mg/kg水平下加標，每個濃度水平重復5次實驗。由表2可知，本方法的日內平均回收率為83.84-96.24%，日內相對標準偏差 (RSD)為1.99-3.78%；日間平均回收率為85.13-95.25%，日間RSD為2.11-3.47%，可以滿足實際樣品的測定需要。

表2　硝磺草酮在大豆上的添加回收率和精密度實驗結果

2.5實際樣品檢測

為驗證本方法的適用性和實用性，對采自貴州、江西、黑龍江和浙江四省不同地區(qū)市場上的40份大豆樣本進行檢測。檢測結果表明，樣本中硝磺草酮的含量均低于方法檢出限。

3結論

通過對流動相組分和流速的考察，建立了檢測大豆中硝磺草酮的HPLC-MS/MS分析方法。同時通過改進的QuEChERS前處理方法處理大豆樣品，重點考察了提取溶劑、提取溶劑用量、提取時間和吸附劑對回收率的影響，簡化了前處理步驟。試驗結果表明，本方法具有準確、簡單、靈敏、快速等優(yōu)點，能有效滿足大豆樣本中硝磺草酮的殘留測定要求，為硝磺草酮在大豆上的殘留分析及市場監(jiān)測提供一種可靠的分析方法。下一步的研究重點是硝磺草酮在大豆上的消解動態(tài)情況。

參考文獻:

[1]Capriotti A L, Caruso G, Cavaliere C,etal. Identification of potential bioactive peptides generated by simulated gastrointestinal digestion of soybean seeds and soy milk proteins [J].JournalofFoodCompositionandAnalysis, 2015(44):205-213.

[2]Dagostin J L A, Carpiné D, Corazza M L. Extraction of soybean oil using ethanol and mixtures with alkyl esters (biodiesel) as co-solvent: Kinetics and thermodynamics [J].IndustrialCropsandProducts, 2015(74):69-75.

[3]Sutton P, Richards C, Buren L,etal. Activity of mesotrione on resistant weeds in maize [J].PestManagementScience, 2002, 58(9):981-984.

[4]Mccurdy J D, Mcelroy J S, Kopsell D A,etal. Effects of Mesotrione on Perennial Ryegrass (Lolium perenne L.) Carotenoid Concentrations under Varying Environmental Conditions [J].JournalofAgricultureandFoodChemistry, 2008(56):9133-9139.

[5]高爽，張宗儉，安偉良，等. 玉米田除草劑甲基磺草酮的生物活性及安全性 [J]. 農藥，2004，43(10): 469-471.

[6]Castorina R, Bradman A, Fenster L,etal. Comparison of Current-Use Pesticide and Other Toxicant Urinary Metabolite Levels among Pregnant Women in the CHAMACOS Cohort and NHANES [J].EnvironmentalHealthPerspectives, 2010(118):856-863.

[7]Oluwole O, Cheke R A. Health and environmental impacts of pesticide use practices: a case study of farmers in Ekiti State [J].InternationalJournalofAgriculturalSustainability, 2009(7):153-163.

[8]CodexAlimentarius Committee (CAC). http://www.codexalimentarius.net/mrls/pestdes/jsp/pest_q-e.jsp.

[9]Barchanska H, Rusek M, Szatkowska A. New procedures for simultaneous determination of mesotrione and atrazine in water and soil. Comparison of the degradation processes of mesotrione and atrazine [J].EnvironmentalMonitoringandAssessment, 2012(184):321-334.

[10]Halle A T, Lavieille D, Richard C. The effect of mixing two herbicides mesotrione and nicosulfuron on their photochemical reactivity on cuticular wax film [J].Chemosphere, 2010(79):482-487.

[11]Alferness P, Wiebe L. Determination of Mesotrione Residues and Metabolites in Crops, Soil, and Water by Liquid Chromatography with Fluorescence Detection [J].JournalofAgricultureandFoodChemistry, 2002(50):3926-3934.

[12]HalleA T, Richard C. Simulated solar light irradiation of mesotrione in natural waters [J].EnvironmentalScience&Technology, 2006(40):3842-3847.

[13]Chen X X, Li W M, Wu Q,etal. Dissipation and Residues of the Herbicide Mesotrione in Maize and Soil in Open Field [J].BulletinofEnvironmentalContaminationandToxicology, 2012(88):772-775.

[14]Pang N N, Wang T L, Hu J Y. Method validation and dissipation kinetics of four herbicides in maize and soil using QuEChERS sample preparation and liquid chromatography tandem mass spectrometry [J].FoodChemistry, 2015(190):793-800.

[15]張代，滕國生，李正強，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定食品中硝磺草酮[J]. 分析化學，2012(5):811-812.

[16]鄧立剛，李增梅，趙善倉，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定玉米中硝磺草酮及其代謝物殘留量[J]. 分析化學，2013, 41(8):1269-1273.

[17]Sun Y B, Xu Y M, Sun Y,etal. Dissipation and Dynamics of Mesotrione in Maize and Soil Under Field Ecosystem [J].BulletinofEnvironmentalContaminationandToxicology， 2013(90):242-247.

[18]儲曉剛，雍煒，凌云，等. 超高效液相色譜一電噴霧串聯(lián)質譜法同時測定大豆中107種除草劑殘留[J]. 分析化學，2008，36(3):325-329.

[19]Ramalhosa M J, Paiga P, Morais S,etal. Oliveira M B. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in fish: evaluation of a quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe extraction method [J].JournalofSeparationScience, 2009(32):3529-3538.

[20]Utture S C, Banerjee K, Dasgupta S,etal. Dissipation and Distribution Behavior of Azoxystrobin, Carbendazim, and Difenoconazole in Pomegranate Fruits [J].JournalofAgricultureandFoodChemistry, 2011(59):7866-7873.

[21]Huan Z B, Xu Z, Lv D Z,etal. Dissipation and Residues of Difenoconazole and Azoxystrobin in Bananas and Soil in Two Agro-Climatic Zones of China [J].BulletinofEnvironmentalContaminationandToxicology, 2013(91):734-738.

A novel QuEChERSmethod to determine the mesotrioneresidue in soybean

WANGXiao-huan,KANGDi,WANGDe-piao,WUYu-e,ZENGSong,ZHANGKan-kan*,HUDe-yu*

(CenterforResearchandDevelopmentofFineChemicals,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025，China)

Abstract:A novel QuEChERS method was developed for the rapid determination of mesotrione residue in soybean using high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The samples were extracted with acetonitrile, then salted out with NaCl, purified with GCB and Cl8, separated on a phenomenex Luna 3u C18 (2) 100A column with gradient elution by using acetonitrile and 0.1% ammonia aqueous as eluant, and detected by HPLC-MS/MS under negative electrospray ionization (ESI-) and multiple-reaction monitoring (MRM) models. Under these conditions, mesotrione showed a good linear relationship (R2>0.997) in the concentration range of 0.0075-0.75 μg/mL, and the limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD) in soybean were 0.003 and 0.0009 mg/kg, respectively. Three spiked levels at 0.003, 0.03 and 0.3 mg/kg were investigated, and the intra-day average recoveries ranged from 83.84% to 96.24%, with intra-day relative standard deviations (RSDs) of 1.993.78%, the inter-day average recoveries ranged from 85.13% to 95.25%，inter-day RSDs of 2.113.47%, which met the requirement of mesotrione determination in soybean.

Key words:Mesotrione; Soybean; QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe); High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

文章編號：1008-0457(2016)01-0029-05國際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.007

中圖分類號：O658

文獻標識碼：A

*通訊作者:胡德禹(1965-)，女，研究員，主要研究方向：農藥殘留分析研究，E-mail:fcc.dyhu@gzu.edu.cn；張侃侃(1984-)，男，副教授，主要研究方向：農藥殘留分析研究，E-mail:kankan16@126.com。

基金項目：公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項 (201203022)；貴州省重大科技專項項目 (黔科合重大專項字[2013]6024號)；貴州大學研究生創(chuàng)新基金項目 (研理工2015052)。

收稿日期：2015-01-11；修回日期：2016-02-10