王　娟　張連國　馬　云　卞偉華

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院細(xì)胞工程教研室　煙臺　264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科；3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室；4 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室

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麥胚凝集素慢病毒載體的構(gòu)建及其表達(dá)的研究

王娟1張連國2馬云3卞偉華4

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院細(xì)胞工程教研室煙臺264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科；3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室；4 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室

【摘要】目的探討麥胚凝集素慢病毒載體的構(gòu)建與表達(dá)的方法。方法采用基因工程方法，將麥胚凝集素的基因插入慢病毒表達(dá)載體Plvx-IRES-ZsGreen1中。再采用慢病毒包裝，將構(gòu)建好的質(zhì)粒和其他三種包裝質(zhì)粒(RPEV、PRRE、VSVG)在293T細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，獲取病毒液后感染人源的脂肪干細(xì)胞(ADSC)。結(jié)果顯微鏡下顯示綠色熒光報告蛋白表示感染成功。對感染后的脂肪干細(xì)胞運用免疫染色技術(shù)進(jìn)行顯色，結(jié)果顯示麥胚凝集素已經(jīng)成功在脂肪干細(xì)胞中實現(xiàn)表達(dá)。結(jié)論慢病毒包裝WGA蛋白的方法可靠高效，可作為一種高效的示蹤技術(shù)廣泛應(yīng)用于各類細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】麥胚凝集素；慢病毒載體；免疫熒光染色；脂肪干細(xì)胞

麥胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)是一種可凝集細(xì)胞的蛋白質(zhì)，可以從多種谷類中提取[1]。WGA可介導(dǎo)體內(nèi)多種生理過程，其通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面上的糖類和蛋白質(zhì)的相互作用參與了宿主細(xì)胞被細(xì)菌和病毒感染的初始步驟、胚胎發(fā)育中的細(xì)胞分化過程以及腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)過程[2，3]，其對生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、組織器官學(xué)以及醫(yī)學(xué)研究都有重要意義。本研究是運用脂肪干細(xì)胞(ADSC)進(jìn)行細(xì)胞療法，觀察其對脊髓損傷的治療效果，前期的工作是運用基因工程的方法將麥胚凝集素導(dǎo)入到慢病毒載體Plvx-IRES-ZsGreen1中，再用慢病毒包裝，將構(gòu)建好的質(zhì)粒和其他三種包裝質(zhì)粒(RPEV、PRRE、VSVG)在293T細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，獲取病毒液后感染人源ADSC，以達(dá)到追蹤的目的，為其分化治療提供顯色追蹤的方法。

1材料與方法

1.1材料293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)、ADSC細(xì)胞(人源脂肪干細(xì)胞)、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、WGA-d質(zhì)粒、plvx-ires-ZsGreen1載體質(zhì)粒(均為濱州醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實驗室提供)；DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(均為美國Gibco公司產(chǎn)品)；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(ThermoFisher)，Sorvall Legend Micro 17R微量高速冷凍離心機(Thermo Scientific)，PowerPac通用電泳儀(Bio-Rad)， GelDoc XR型凝膠成像系統(tǒng)(BioRad)，JB-CJ-2FX潔凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備)， 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海?，?，高溫滅菌鍋(上海博訊)，電子天平(北京Sartorius，NanoDrop 2000 超微量分光光度計(賽默飛世爾)，熒光顯微鏡(奧林巴斯，BX53)。

1.2方法

1.2.1重組慢病毒表達(dá)載體Plvx-WGA-IRES-Zs-Green1的構(gòu)建 分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切目的片段模板質(zhì)粒WGA-d和慢病毒載體質(zhì)粒Plvx-IRES-ZsGreen1，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收并純化目的條帶，用DNA連接酶將純化的WGA片段與Plvx-IRES-ZsGreen1載體片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，酶切鑒定，最終測序鑒定。

1.2.2293T細(xì)胞及ADSC細(xì)胞的培養(yǎng)293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，ADSC細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩種細(xì)胞均在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3慢病毒包裝將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1以及其他三種包裝質(zhì)粒RPEV、PRRE、VSVG質(zhì)粒在293T細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。然后放置到37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24 h后用新鮮培養(yǎng)基更換細(xì)胞培養(yǎng)液，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡下觀察病毒包裝效果。

1.2.4感染ADSC細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，取共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的培養(yǎng)液于新的離心管中。用0.45 μm的濾器過濾病毒液于無菌的干凈收集管中。取出生長狀態(tài)良好，匯合率70%左右ADSC細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)基。向ADSC中加入原培養(yǎng)液體積的過濾后的病毒液。

1.2.5免疫熒光染色檢測感染效果將24孔板細(xì)胞的培養(yǎng)液棄去，用500 μL 4%的多聚甲醛溶液固定20 min。1 mL 0.2% 吐溫-20℃處理10 min。封閉液處理60 min后，加入一抗anti-WGA 500 μL，4℃，過夜。PBS洗滌3次后，加入500 μL二抗處理120 min。避光加入 DAPI (1 μg/mL)500 μL，室溫下處理15 min。熒光顯微鏡下檢測感染效果。

2結(jié)果

2.1重組慢病毒表達(dá)載體Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1的構(gòu)建分別將WGA-d質(zhì)粒和慢病毒載體Plvx-IRES-ZsGreen1進(jìn)行酶切(圖1)，1號泳道是酶切后的原WGA-d質(zhì)粒，2號泳道是酶切后的Plvx-IRES-ZsGreen1載體。在1號泳道處可以看到四條條帶，其中圖片最下方的1 000 bp左右的是需要切膠回收的WGA片段。2號泳道共有兩個條帶，圖片下方較亮的是沒有切開的質(zhì)粒，上方的是切開一個缺口的質(zhì)粒，即需要膠回收的目的條帶。將酶切后的目的片段WGA和慢病毒載體質(zhì)粒Plvx-IRES-ZsGreen1，進(jìn)行純化、回收連接反應(yīng)后。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，最終經(jīng)測序鑒定，測序結(jié)果表明Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1中的WGA序列與WGA-d質(zhì)粒中的WGA序列完全一致，沒有突變。

2.2慢病毒包裝構(gòu)建好的Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1載體是一種慢病毒表達(dá)載體，可以將插入的蛋白即WGA蛋白和ZsGreen1在ADSC細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行共表達(dá)。ZsGreen1是一種綠色熒光蛋白，可以作為標(biāo)記蛋白。將vx-WGA-IRES-ZsGreen1質(zhì)粒、RPEV、 PRRE、 VSVG質(zhì)粒在293T細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞中含有大量帶有綠色熒光蛋白的病毒顆粒(圖2)，說明慢病毒包裝成功。收取病毒液，感染宿主細(xì)胞ADSC，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量綠色熒光蛋白(圖3)，推測WGA蛋白在ADSC中得到成功表達(dá)。

2.3免疫熒光染色檢測WGA蛋白為了更加準(zhǔn)確的顯示ADSC細(xì)胞內(nèi)WGA蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步利用免疫染色的方法進(jìn)行檢測。紅色熒光代表被WGA抗體染色后的WGA蛋白表達(dá)情況(圖4A)，藍(lán)色熒光代表DAPI染色后的細(xì)胞核(圖4B)，合并后發(fā)現(xiàn)Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1重組載體同時表達(dá)出綠色熒光蛋白ZsGreen1和紅色熒光蛋白WGA(圖4C)，WGA蛋白成功在ADSC細(xì)胞中得到大量表達(dá)。

3討論

WGA的外源性功能包括對脂肪代謝的影響、對細(xì)胞膜通透性的影響、對成纖維細(xì)胞增殖的抑制、對免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用等[4，5]，WGA是研究細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)受體等的重要探針[6]。有實驗采取基因工程的方法，將WGA-cDNA片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體中，用腺病毒包裝后感染細(xì)胞，當(dāng)導(dǎo)入的目的基因在神經(jīng)元特異的啟動子表達(dá)后即可通過觀察WGA以達(dá)到示蹤的效果[7]。實驗在小鼠和果蠅上都取得了預(yù)期的效果[8]。而在一些神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默病、肌萎縮側(cè)索硬化以及常見的運動神經(jīng)元損傷疾病和脊髓損傷疾病的研究和治療中，能夠標(biāo)記到相關(guān)的神經(jīng)元進(jìn)行追蹤尤為重要[9，10]。

慢病毒包裝WGA蛋白的方法可以作為一種高效的示蹤技術(shù)廣泛應(yīng)用于各類細(xì)胞。特別是WGA對神經(jīng)元細(xì)胞具有特異性，又能夠跨突觸傳遞，這使得運用慢病毒包裝WGA來進(jìn)行神經(jīng)元示蹤具有特別的優(yōu)越性[11]。一方面可以進(jìn)行原位注射病毒的辦法追蹤神經(jīng)元的生長和遷移，另一方面，WGA的神經(jīng)元特異性和順行逆行的特性可用于追蹤和標(biāo)記功能和結(jié)構(gòu)相關(guān)的神經(jīng)通路[12，13]。這都使得關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)的研究更為準(zhǔn)確、快捷。此外，采用慢病毒包裝WGA進(jìn)行干細(xì)胞的體內(nèi)分化示蹤研究也具有一定優(yōu)勢。

本實驗通過現(xiàn)代基因工程的方法將WGA蛋白的序列成功的插入到慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1中。成功的構(gòu)建了WGA的慢病毒表達(dá)載體。并將該表達(dá)載體和其他三種包裝質(zhì)粒(RPEV、PRRE、VSVG)通過與293T細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，包裝成病毒顆粒。收取病毒液后，用其感染ADSC，顯微鏡下檢測感染成功后，再用免疫熒光染色技術(shù)，將WGA蛋白染色觀察。結(jié)果顯示，WGA蛋白在ADSC中實現(xiàn)了高效表達(dá)并成功染色。為下一步運用ADSCs進(jìn)行細(xì)胞療法，觀察其對脊髓損傷的治療效果，為ADSCs分化治療提供顯色追蹤提供基礎(chǔ)。

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Study on the construction and expression of lentivirus-wheat germ agglutinin expressing vector

WANG Juan1ZHANG Lianguo2MA Yun3BIAN Weihua4

1 Department of cell engineering, School of Pharmaceutical Sciences, Binzhou Medical University, Yantai 264003, P.R.China;2 Department of Thoracic Surgery, Binzhou Medical University Hospital; 3 Department of Central Laboratory, Binzhou Medical University Hospital; 4 Department of Cell biology, School of Pharmaceutical Sciences, Binzhou Medical University

【Abstract】ObjectiveTo investigate the construction and expression of wheat germ agglutinin lentivirus expression vector.MethodsBy using genetic engineering methods,The WGA gene were inserted into a lentivirus expression vector Plvx IRES-ZsGreen1.Then the recombinant plasmid and three other kinds of packaging plasmid (RPEV,PRRE and VSVG) were used to co-transfect with 293T cells till getting the virus and then infected the human adipose tissue-derived stem cells (ADSCS).After that, we dyed the ADSC by using immunofluorescence technique.ResultsThe results showed that the WGA protein was expressed successfully in adipose stem cells.ConclusionsThe method of packaging WGA protein in lentivirus is reliable and efficient, which could be used for the next step of tracer experiment.

【Keywords】Wheat germ agglutinin,lentivirus vector,immunofluorescence technique,adipose tissue-derived stem cells

(收稿日期：2015-11-14)

【中圖分類號】Q812

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1001-9510(2016)02-0092-04

通訊作者：卞偉華,E-mail：492752507@qq.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31401258)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2012BM006)