呂文文　張金杰　丁召興　魏傳梅

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部　濱州　256603

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HPLC法測定不同產(chǎn)地野菊花兩種黃酮苷的含量

呂文文張金杰丁召興魏傳梅

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部濱州256603

【摘要】目的通過HPLC法測定不同產(chǎn)地野菊花中蒙花苷與香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量，控制入藥野菊花的質(zhì)量。方法采用Welchrom C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，甲醇-水-醋酸(52∶46∶2)流動相洗脫，流速 1.0 mL·min-1，檢測波長334 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果安徽、山東產(chǎn)的野菊花兩種黃酮苷含量較高，約為其他產(chǎn)地的2倍。結(jié)論不同產(chǎn)地野菊花中蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量差異較大，入藥時應(yīng)選擇黃酮苷類含量較高的野菊花。

【關(guān)鍵詞】HPLC；野菊花；含量測定；黃酮苷

野菊花為菊科植物野菊(Flos Chrysanthemi Indici)干燥頭狀花序，味苦、辛，性微寒，歸肝心經(jīng)。具有疏風(fēng)清熱，消腫解毒之功效。野菊花主要產(chǎn)于江蘇、四川、廣西、山東、安徽等地[1]。主要含有揮發(fā)油、萜類、黃酮類等成分[2]，黃酮類包括蒙花苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷等[3，4]?，F(xiàn)代藥理實驗研究表明野菊花主要有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等功效[5，6]；黃酮類化合物抗炎鎮(zhèn)痛作用明顯，多種黃酮協(xié)同作為野菊花藥效組分[7]。測定不同產(chǎn)地野菊花黃酮類含量，可較好地控制野菊花質(zhì)量[8，9]，本研究采用HPLC法對不同產(chǎn)地的野菊花中蒙花苷、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷等兩種黃酮苷類同時進(jìn)行含量測定，綜合評價野菊花黃酮類成分質(zhì)量，建立野菊花黃酮苷類成分評價方法，更好地控制野菊花用藥的有效性。

1儀器與試藥

Waters 600 controller，Waters2487 Dual λ Absorbance Detector(美國waters公司)；十萬分之一分析天平(日本SHIMADZU AUW120D)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(丹瑞 HH-D4)；粉碎機 (屹立)；甲醇(天津四友)、乙腈均為色譜級(Fisher scientific)；醋酸(國藥集團(tuán))、磷酸(國藥集團(tuán))均為分析純；蒙花苷、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷，實驗室自制 (經(jīng)波譜數(shù)據(jù)鑒定，HPLC測定，歸一化法計算，蒙花苷(純度≥98.1%)，香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷(純度≥98.0%)；野菊花藥材于山東、安徽、江蘇、浙江、河南、湖北等各地及當(dāng)?shù)厮幍瓴杉c購買。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備精密稱取蒙花苷對照品2.8 mg和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品1.6 mg分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋定容，制成280 mg·L-1和 160 mg·L-1的對照品溶液。然后分別精密量取8、1 mL上述對照品溶液于25 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，制成 89.6 μg·mL-1蒙花苷，6.4 μg·mL-1香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷混合對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備將干燥的野菊花粉碎，過60目篩，精密稱取粉末 0.2 g于具塞錐形瓶中，精密加入 70%甲醇溶液150 mL，稱重，浸泡過夜，加熱回流3 h，放冷，稱重，70%甲醇補足重量，搖勻過0.45 μm濾膜既得。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)實驗色譜柱：Welchrom C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水-醋酸(52∶46∶2)；流速1.0 mL·min-1；柱溫具體溫度；檢測波長334 nm；進(jìn)樣量20 μL。野菊花對照品與樣品HPLC圖見圖1。

在此條件下蒙花苷與香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷分離度分別為R>2.2，R>2.5；理論塔板數(shù)按蒙花苷計算5 803 ，香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷7 219；拖尾因子和不對稱度分別為1.002，1.009和1.039，1.037。

圖1野菊花對照品與樣品HPLC圖

2.4線性關(guān)系分別精密吸取“2.1”項下蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品混合溶液0.5、1、2、3、5、7 mL于10 mL容量瓶中定容，HPLC進(jìn)針20 μL量，測定峰面積。以進(jìn)樣量(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。蒙花苷在0.089 6～1.254 4 μg范圍內(nèi)和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.006 4～0.089 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

表1　野菊花中2種黃酮苷成分的線性關(guān)系

2.5精密度取蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷濃度為8.96和0.64 μg·mL-1混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)針6次，每次20 μL，測定峰面積。結(jié)果蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷RSD分別為0.23%，0.55%(n= 6)。表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性取“2.2”項下制備的野菊花供試液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣20 μL，測定峰面積。蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷RSD分別為1.48%，2.36%(n=6)。表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性精密稱取野菊花6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，HPLC各進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計算含量。蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量RSD分別為0.91%，2.47%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率稱取已知蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量的的野菊花6份，每份0.1 g。分別精密加入已知濃度的蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液。按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計算含量，結(jié)果符合規(guī)定，見表2。

表2　加樣回收率結(jié)果

2.9樣品含量測定精密稱取不同產(chǎn)地的野菊花，每份0.2 g，按照“2.2”項方法制備供試液，進(jìn)樣20 μL，在上述色譜條件下測定峰面積。用回歸方程計算6批次野菊花含量，結(jié)果見表3。

表3　不同產(chǎn)地野菊花中蒙花苷和香葉木素

3討論

野菊花黃酮類成分抗炎，鎮(zhèn)痛活性較佳[10～13]，為野菊花主要活性成分，尤其以蒙花苷活性較佳，考慮以蒙花苷母核相近的一系列黃酮苷類化合物如香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷作為活性成分指標(biāo)，來優(yōu)選活性較好的野菊花入藥。野菊花分布較為廣泛，不同產(chǎn)地野菊花黃酮類化合物含量各有差異，為了保證野菊花用藥有效性、安全性，在考察蒙花苷含量同時還要考慮其他黃酮苷類含量，為此首次選定含量較高的蒙花苷和含量較低的香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷為指標(biāo)，以保證控制野菊花黃酮類成分完整性及多樣性。

提取條件選擇考察，《中國藥典》(2010版)以純甲醇提取，僅僅考察了蒙花苷含量，忽略了其他苷類的有效提取量，因此本實驗考察了常用的不同提取溶劑，不同比例提取溶劑，不同提取方式，不同提取時間，不同的加入提取溶劑倍數(shù)等條件[14]，測定兩種黃酮苷含量變化。甲醇提取時野菊花中香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷量含量較多，優(yōu)選甲醇提取。考察了甲醇、80%甲醇-水、70%甲醇-水、50%甲醇-水等不同比例提取，香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量在70%甲醇左右最大量，并且蒙花苷含量降低較少，因此選用70%甲醇-水，黃酮苷類隨著提取溶劑量增加而增加，因此選用500倍量溶劑，可將黃酮類提取完全。

色譜條件考察。本實驗考察乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水-醋酸、乙腈-水-磷酸、甲醇-水-醋酸、甲醇-水-磷酸等條件，乙腈-水-磷酸各種峰分離效果較佳，但是出峰時間較長，兩種黃酮苷在甲醇-水-醋酸等度條件下即可達(dá)到快速、較好分離?？疾炝薟elchrom C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Diamonsil (4.6 mm×200 mm，5 μm)、HPLC Packed column (4.6 mm×200 mm，5 μm )不同色譜柱效果，后兩者拖尾因子和不對稱度較大，最終選擇Welchrom C18 色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)?？疾炝耸覝?、30、35、40℃不同柱溫，發(fā)現(xiàn)柱溫增加出峰時間較短，但是蒙花苷會與其他化合物重疊，影響其分離，并且理論塔板數(shù)降低，因此選擇室溫。

本實驗用等度洗脫可快速、簡便、同時測定蒙花苷和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量，測定方法簡單，快速，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，可用于野菊花黃酮苷類化合物快速質(zhì)量控制。

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Determination of the contents of two flavonoid glycosides in Flos Chrysanthemi Indici from different habitats by HPLC

LYU WenwenZHANG JinjieDING ZhaoxingWEI Chuanmei

Department of Pharmacy,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603, P.R.China

【Abstract】ObjectiveTo establish a HPLC method for determining the contents of linarin and diosmetin-7-O-β-D-glucopyranoside in Flos Chrysanthemi Indici from different habitats for the quality of Flos Chrysanthemi Indici.MethodsTwo flavonoid glycosides were separated on Welchrom C18(4.6×250 mm 5μm)with mobile phase consisted of methanol-water-acetic acid (52∶4∶6∶2) at a flow rate of 1.0 mL·min-1at the room temperature.The detective wavelength was set at 334 nm.ResultsContents of two flavonoid glycosides in Flos Chrysanthemi Indici from Anhui and Shandong were higher than that from Jiangsu and Henan.ConclusionsThe contents of linarin and diosmetin-7-O-β-D-glucopyranoside in Flos Chrysanthemi Indicifrom different habitats are quite different,we should choose the most suitable Flos Chrysanthemi Indici.

【Keywords】HPLC,Flos Chrysanthemi Indici,content determination,flavonoid glycosides

(收稿日期：2015-08-12)

【中圖分類號】R93

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1001-9510(2016)02-0120-04

通訊作者：張金杰，E-mail:zhangjinjie86@163.com