崔冬冰， 范安然， 何志旭

(貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實驗中心， 貴州 貴陽　550004)

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人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法的改進(jìn)*

崔冬冰， 范安然， 何志旭**

(貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實驗中心， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 建立一種高效分離培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。方法： 分別用酶消化法、傳統(tǒng)組織塊貼壁法和改進(jìn)的組織塊貼壁法分離出hAMSCs，觀察3種方法所獲得hAMSCs細(xì)胞形態(tài)、獲得時間，流式細(xì)胞學(xué)檢測其免疫表型；并用不同的誘導(dǎo)體系將hAMSCs向成骨細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，鑒定其分化潛能。結(jié)果： 改進(jìn)的組織塊貼壁法獲得hAMSCs細(xì)胞的純度更高，傳代次數(shù)更多，相同的培養(yǎng)時間里，獲得的細(xì)胞數(shù)量是酶消化法的3～4倍，是傳統(tǒng)組織塊貼壁法的1～2倍；hAMSCs細(xì)胞高表達(dá)CD73、CD90、CD44和CD105，不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；茜素紅染色和神經(jīng)元特異性烯醇化酶檢測證實hAMSCs細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)論： 改進(jìn)的hAMSCs分離培養(yǎng)方法可獲得較大數(shù)量細(xì)胞，且保留了向神經(jīng)細(xì)胞或成骨細(xì)胞可分化潛能。

[關(guān)鍵詞]人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞培養(yǎng)； 鑒定； 誘導(dǎo)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有高度增殖和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，來源廣泛，可從多個器官或組織中分離獲得，因具有低免疫原性等特點(diǎn)，而成為細(xì)胞療法的主要種子細(xì)胞，有著廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前已從骨髓、脂肪、肌肉、肺、肝、胰腺、羊水、胎盤[2-3]、臍血等組織或器官中分離獲得MSCs，胎盤的羊膜組織取材方便、易于分離獲得MSCs，不受倫理學(xué)限制，MSCs含量豐富等優(yōu)勢受到研究者的青睞。目前，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amnionmesenchymal stem cells，hAMSCs)的原代培養(yǎng)常采用酶消化法和傳統(tǒng)的組織塊貼壁法，但常常會因為操作時間長或是組織塊不能貼壁而影響hAMSCs的得率。因此，分離方法進(jìn)行了改進(jìn)，以求建立一種高效的本實驗對hAMSCs的分離培養(yǎng)方法。

1材料與方法

1.1標(biāo)本

羊膜組織取自健康足月新生兒剖宮產(chǎn)手術(shù)后，經(jīng)家屬和產(chǎn)婦知情同意并簽署《胎盤處理協(xié)議書》后捐獻(xiàn)所得。

1.2主要材料與儀器

L-DMEM(美國Gibco公司)、胎牛血清FBS(美國Hyclone公司)、0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)、1 g/L Ⅱ型膠原酶(美國Hyclone公司)及雙抗(青-鏈酶素混合液，美國Gibco公司)、Human MSC Analysis Kit(BD 562245)透氣式細(xì)胞培養(yǎng)瓶(NEST)、細(xì)胞計數(shù)板、超凈工作臺(蘇州凈化)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱( 美國Thermo)、流式細(xì)胞儀(美國 Backman MoFlo XDP)、倒置顯微鏡(Nikon TE-2000)、低溫冷凍離心機(jī)(德國eppendorf 5810)及正置顯微鏡(美國Leica)。

1.3hAMSCs分離和培養(yǎng)無菌條件下剝離靠近臍帶處的羊膜組織， NS清洗并轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶中，眼科剪剪成直徑約2.0 mm的組織塊。(1)酶消化法：在組織中加入1 g/L Ⅱ型膠原酶，37 ℃，12 h，然后再加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃，15 min，吸出上清并加入培養(yǎng)液(L-DMEM+10%FBS+1%雙抗)混勻， 1 000 r/min，3 min，沉淀用培養(yǎng)液重懸，轉(zhuǎn)入T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。(2)傳統(tǒng)組織塊貼壁法：將組織塊放入T75培養(yǎng)瓶中，每瓶放置10～12個，間隔0.5 cm，然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日換液。待見有細(xì)胞從組織塊周圍爬出時，隔日換液。(3)改進(jìn)組織塊貼壁法：將組織塊放入T75培養(yǎng)瓶中，擰松瓶蓋，垂直地放在超凈工作臺上，干燥1～2 h后，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日換液。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1細(xì)胞生長情況從第3日起每日進(jìn)行觀察，包括細(xì)胞出現(xiàn)的時間、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞達(dá)到90%融合所需的時間，計數(shù)P1代hAMSCs培養(yǎng)第15天時的細(xì)胞數(shù)量。

1.4.2免疫表型鑒定按照流式檢測試劑盒使用說明操作，檢測P3代hAMSCs細(xì)胞膜表面分子：CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5和CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。

1.4.3分化潛能及鑒定取P3代hAMSCs細(xì)胞按2.0×103/cm2接種于六孔板中，并用神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑(H-DMEM、 2% DMSO、200 μmoL/L丁羥基茴香醚)和成骨誘導(dǎo)劑(H-DMEM培養(yǎng)基、10 mmoL/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L 維生素C、10-8moL/L地塞米松)將hAMSCs分別向神經(jīng)細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并用免疫組化法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和成骨結(jié)節(jié)。以未行誘導(dǎo)的hAMSCs作為對照。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1細(xì)胞生長情況

2.1.1酶消化法接種后6 h左右有少量hAMSCs細(xì)胞貼壁，第3天可見細(xì)胞呈長梭形或多角形生長(圖1-A)，細(xì)胞融合達(dá)90%需要約18 d，傳代后細(xì)胞生長速度變緩，P1代培養(yǎng)第15天每T25培養(yǎng)瓶細(xì)胞計數(shù)為(3.8±0.28)×103個(表1，圖1-B)。

2.1.2傳統(tǒng)組織塊貼壁法接種第15天可見有組織塊周圍有少量hAMSCs細(xì)胞爬出，形態(tài)以梭形為主(圖1-C)，細(xì)胞融合達(dá)到90%需要約25 d，P1代培養(yǎng)第15天每T25培養(yǎng)瓶細(xì)胞計數(shù)為(10.3±0.50)×103個(表1，圖1-D)。

2.1.3改進(jìn)組織塊貼壁法接種第10天可見hAMSCs細(xì)胞爬出，形態(tài)特征同上(圖1-E)，細(xì)胞融合達(dá)到90%需18 d，傳代細(xì)胞增殖迅速，P1代培養(yǎng)第15天每T25培養(yǎng)瓶細(xì)胞計數(shù)為(21.5±0.52)×103個(表1，圖1-F)。

2.2免疫表型鑒定

流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示(圖2)，CD73和CD90表達(dá)量為97%、CD44和CD105表達(dá)量為95.4%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR分子表達(dá)量為0.02% 。

注：A為酶消化法原代培養(yǎng)第3天；B為酶消化法P1代培養(yǎng)第15天；C為傳統(tǒng)組織塊貼壁法原代培養(yǎng)第15天；D為傳統(tǒng)組織塊貼壁法P1代培養(yǎng)第15天；E為改進(jìn)組織塊貼壁法原代培養(yǎng)第10天；F為改進(jìn)組織塊貼壁法P1代培養(yǎng)第15天圖1　hAMSCs的生長情況(×100)Fig.1　The growth situation of hAMSCs

圖2　第3代hAMSCs細(xì)胞表面分子(流式細(xì)胞)Fig.2　The flow cytometry detection of 3rd generation hAMSCs

2.3分化潛能鑒定

2.3.1hAMSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化hAMSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)4 h后，細(xì)胞形態(tài)上由長梭形變成三角形或多角形，并且有多個神經(jīng)軸突，NSE檢測，DAB染色為黃色，表明hAMSCs具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力(圖3-B)。

2.3.2hAMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞匯合聚集后呈多層重疊生長，形成成骨細(xì)胞特有的礦化結(jié)節(jié)，周圍折光性增強(qiáng)，茜素紅染色呈紅色，表明hAMSCs具有向成骨細(xì)胞分化的能力(圖3-C)。

注：A為對照組(100×)，B為向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)28 h(DAB，×400)，C為向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)14 d染色(茜素紅，×40)圖3　hAMSCs誘導(dǎo)分化情況Fig.3　Differentiation experiment of hAMSCs

細(xì)胞生長特點(diǎn)hAMSCs酶消化法傳統(tǒng)組織塊貼壁法改進(jìn)組織塊貼壁法細(xì)胞出現(xiàn)時間(d)3.00±0.2215.00±0.3210.00±0.44原代達(dá)到90%融合的時間(d)18.00±0.4525.00±0.2420.00±0.13P1代培養(yǎng)15d細(xì)胞數(shù)量(×103個)3.80±0.2810.30±0.5021.50±0.52

注：組間比較P<0.05

3討論

目前，關(guān)于hAMSCs的分離培養(yǎng)方法，文獻(xiàn)報道中各不相同，但主要包括酶消化法和組織塊法，這兩種方法分離培養(yǎng)出的MSCs形態(tài)特征、生長曲線、細(xì)胞表面標(biāo)記物等無明顯差異。但各有利弊，酶消化法成本較高，操作比較繁瑣，污染概率大；消化過程時間過短，細(xì)胞很難爬出；消化時間過長易損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞的增殖傳代能力[4]。

本研究通過采用酶消化法、傳統(tǒng)組織塊法和改進(jìn)組織塊貼壁法從人胎盤羊膜中成功分離、培養(yǎng)出hAMSCs，觀察發(fā)現(xiàn)，酶消化法雖能在短時間內(nèi)獲得細(xì)胞，但混有較多的雜細(xì)胞，消化時間難以控制，傳代后細(xì)胞不易貼壁，影響其增殖能力，相同的傳代培養(yǎng)時間能獲得的細(xì)胞數(shù)量較少。傳統(tǒng)組織塊貼壁法會有大量的組織塊不能緊貼在培養(yǎng)瓶底部，而已經(jīng)爬出的細(xì)胞，由于數(shù)量少，不具備傳代的條件，長時間培養(yǎng)容易致細(xì)胞分化，相同的傳代培養(yǎng)時間里也不能獲得滿意的細(xì)胞數(shù)量。改進(jìn)組織塊貼壁法可以使羊膜組織塊緊貼在瓶底，避免了組織塊漂浮，增加了細(xì)胞爬出的機(jī)會，縮短了原代培養(yǎng)的時間，確保了傳代細(xì)胞的活性和穩(wěn)定性。

對于hAMSCs第1次傳代培養(yǎng)，通常都是按照1∶1或1∶2傳代，而這種方法常常因為細(xì)胞密度低而導(dǎo)致細(xì)胞貼壁難、數(shù)量少、需要延長培養(yǎng)時間，容易出現(xiàn)細(xì)胞分化現(xiàn)象，影響細(xì)胞質(zhì)量，而本實驗用T75培養(yǎng)瓶進(jìn)行原代培養(yǎng)，P1代傳至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，提高了接種密度，增加了貼壁細(xì)胞的數(shù)量，更有利于保持細(xì)胞的活性，加速細(xì)胞的增殖和傳代，其原因可能與改善了其生長的微環(huán)境，細(xì)胞通過自分泌和旁分泌途徑分泌相關(guān)細(xì)胞因子促進(jìn)其生長[5]。

對于MSCs的鑒定一直沒有一個絕對統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前都是參照骨髓MSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)來執(zhí)行的，主要通過一般生物學(xué)特性、細(xì)胞表面標(biāo)記物、多向分化潛能等途徑進(jìn)行鑒定。hAMSCs能表達(dá)多種細(xì)胞表面抗原，包括CD13、CD29、CD44、CD105、CD90、CD73，不表達(dá)或是低表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原[6]。因此，本實驗選擇了幾個常見的標(biāo)記物，包括：CD73、CD90、CD44、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR。結(jié)果顯示，細(xì)胞高表達(dá)CD44、CD105、CD73和CD90，這與骨髓和其他來源的MSCs表達(dá)情況一致[7]。另外，通過誘導(dǎo)劑將其向神經(jīng)[8]和成骨細(xì)胞[9]誘導(dǎo)，提示該細(xì)胞具備分化潛能，以上結(jié)果說明該細(xì)胞符合MSCs的特征[10]。

總之，本研究對hAMSCs原代培養(yǎng)的方法上進(jìn)行了改進(jìn)，縮短了培養(yǎng)時間，提高了細(xì)胞的得率，為今后其臨床應(yīng)用提供了保障。

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(2016-02-13收稿，2016-03-27修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

The Improved Culture Method of Human Amnion Mesenchymal Stem Cells

CUI Dongbing, FAN Anran, HE Zhixu

(TheCenterofStemCellandTissueEngineeringResearch,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate and improve the method of human amnion mesenchymal stem cellsseparation and culture (hAMSCs). Methods: The hAMSCs were established with the methods of trypsin, collagenase II, traditional and improved tissue attachment, respectively. The cell morphology and the growth time of hAMSCs were observed, and the immunophenotype were also detected with flow cytometry. In addition, hAMSCs were induced to differentiate into osteoblast and neuroblast with different system and the derived osteoblast and neuroblast were identified then. Results: The hAMSCs obtained with the improved separation method obtain higher purity and can be passaged more times, and the quantity of obtained hAMSCs can be reached up to 3～4 times of enzyme digestion, and 1～2 times of traditional tissue attachment method within the same culture time; furthermore, the obtained hAMSCs highly express CD73, CD90, CD44 and CD105 while did not express CD11b, CD19, CD34, CD45 and HLA-DR; the alizarin staining and neuron-specific enolase detection demonstrated that hAMSCs could be induced into osteoblast and neuroblast. Conclusions: The methods of hAMSCs separation and culture are improved and will provide the basis for the research and application of hAMSC.

[Key words]human amnion mesenchymal stem cells(hAMSCs); cell culture; identification； induce

[中圖分類號]R329.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0414-04

*[基金項目]貴州省科技廳貴州醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合基金[黔科合LH字(2014)7078]

**通信作者 E-mail:hzx@gmc.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1844.046.html