李春杰，胡巖峰，王從麗

(中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081)

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黑龍江省大慶市大棚蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)和小種的鑒定

李春杰，胡巖峰，王從麗

(中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081)

摘要：為明確黑龍江省大慶市棚室內(nèi)蔬菜上根結(jié)線蟲(chóng)的種類(lèi)和小種，研究采用PCR技術(shù)鑒定線蟲(chóng)的種類(lèi)和鑒別寄主法確定南方根結(jié)線蟲(chóng)的小種。結(jié)果表明，大慶市棚室內(nèi)番茄和黃瓜上根結(jié)線蟲(chóng)僅為南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne incognita)，并且是1號(hào)小種，未發(fā)現(xiàn)其他種的根結(jié)線蟲(chóng)。圖2，表2，參13。

關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲(chóng)；種類(lèi)鑒定；PCR技術(shù)；鑒別寄主法；黑龍江省

根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogynespp.)是一類(lèi)危害非常嚴(yán)重的植物寄生線蟲(chóng)，也是蔬菜栽培中普遍發(fā)生的一種病害。受害作物年損失率約10 %，而其中由南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)、花生根結(jié)線蟲(chóng)(M.arenaria)和北方根結(jié)線蟲(chóng)(M.hapla)4 種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)造成的損失占90 %[1]。在我國(guó)南方地區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)生相當(dāng)嚴(yán)重，在寒冷的東北地區(qū)發(fā)生相對(duì)較輕，尤其在黑龍江省的露地蔬菜幾乎沒(méi)有發(fā)生，因?yàn)楦Y(jié)線蟲(chóng)在黑龍江省不能越冬。但是在黑龍江省的溫室和大棚內(nèi)由于受保護(hù)地密閉、高溫、高濕和復(fù)種指數(shù)增加等因素影響，蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)生呈逐年加重趨勢(shì)。根結(jié)線蟲(chóng)對(duì)同一種作物的致病性存在顯著的種間差異，因此，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)的鑒定和小種的確定是防治該病的前提條件。此研究通過(guò)PCR技術(shù)鑒定線蟲(chóng)的種類(lèi)和鑒別寄主法進(jìn)一步確定南方根結(jié)線蟲(chóng)的小種，為生產(chǎn)實(shí)踐中有效防治當(dāng)?shù)厥卟烁Y(jié)線蟲(chóng)病提供科學(xué)依據(jù)，從而更有針對(duì)性地選擇抗病作物和品種及其防治措施。

1材料與方法

1.1樣本的采集

從黑龍江省大慶市發(fā)病嚴(yán)重的大棚內(nèi)挖取被根結(jié)線蟲(chóng)危害的番茄根和黃瓜根(黑龍江省大慶市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心提供)，裝入封口塑料袋中，快遞到實(shí)驗(yàn)室。挑取樣品組織內(nèi)根結(jié)線蟲(chóng)的數(shù)個(gè)單卵塊，分別接種到滅菌沙土(2∶1)盆栽的番茄根附近(距根1 cm處打孔)進(jìn)行大量繁殖，以供實(shí)驗(yàn)室PCR鑒定和下一步溫室盆栽小種的鑒定。爪哇根結(jié)線蟲(chóng)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院提供，寄主為空心菜；北方根結(jié)線蟲(chóng)由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供，寄主是番茄。挑取根上多個(gè)單卵塊，分別接種到溫室滅菌沙土盆栽的番茄根部進(jìn)行繁殖，方法同大慶樣品。

1.2根結(jié)線蟲(chóng)DNA提取

從植物根組織中挑取多個(gè)卵塊，置于28℃培養(yǎng)箱孵化3 d～4 d。挑出已孵化的多條線蟲(chóng)放入無(wú)菌水中，并利用手術(shù)刀在解剖鏡下將蟲(chóng)體切碎，將蟲(chóng)體及內(nèi)含物(8 μl)轉(zhuǎn)移至PCR管中，同時(shí)加入2 μl裂解液(10 × PCR buffer與20 mg·ml-1蛋白酶K等體積混合)。PCR管在-80℃冰箱冷凍30 min，隨后放入PCR儀(Bio-Rad S1000TMThermal Cycler)中65℃條件下反應(yīng)90 min，95℃下處理10 min使蛋白酶K變性。12 000 rpm離心5 min，取上清液(DNA模板)用于PCR擴(kuò)增，或置于-20℃冰箱備用。

PCR擴(kuò)增：

根據(jù)Blok等[2]設(shè)計(jì)的根結(jié)線蟲(chóng)rDNA序列的擴(kuò)增引物F194/F195對(duì)檢測(cè)根結(jié)線蟲(chóng)種群5S和18S的IGS保守序列間隔區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為25 μl，包括10 × PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，上游和下游引物0.4 μl，Taq聚合酶0.5 μl，DNA模板2 μl，加ddH2O至25 μl。PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃ 變性30 s，53℃ 退火30 s，72℃ 延伸90 s，40 個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。采用根結(jié)線蟲(chóng)的特異性引物對(duì)大慶線蟲(chóng)群體進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)總體系為25 μl，其中10 × PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，上游和下游引物各0.4 μl，Taq聚合酶0.5 μl，DNA模板2 μl，加ddH2O至25 μl。PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃ 退火45 s，72℃延伸50 s，40 個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。取5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為85 V。使用EP凝膠成像儀觀察、照相和記錄。

表1　不同種根結(jié)線蟲(chóng)引物序列參照表

1.3鑒別寄主法對(duì)小種的鑒定

用鑒別寄主試驗(yàn)方法鑒定南方根結(jié)線蟲(chóng)的小種。首先將煙草(Nicotianatabacum品種為NC95，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所王鳳龍研究員提供)和番茄(Lycopersionesculentum品種為中蔬4號(hào)，從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi))播種育秧盤(pán)中，穴內(nèi)裝有滅菌的草炭土∶蛭石=1∶1(體積比)，每穴3株～5株苗，出苗40 d和20 d后移栽到裝有滅菌的沙∶土=2∶1的小盆中，盆深10 cm，盆上口直徑15 cm，裝沙土1 100 g，移栽1周后接種線蟲(chóng)。棉花(Gossypiumhirsutum品種為泗棉3號(hào)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張寶龍研究員提供)直接播種到同樣大小的沙土盆中，出苗10 d后接種線蟲(chóng)，每盆保苗1株。所有寄主接種根結(jié)線蟲(chóng)的量均為5 000個(gè)卵·(盆·株)-1，接種45 d扣盆調(diào)查每株根系上根結(jié)數(shù)量，根結(jié)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)根結(jié)的為0級(jí)；1個(gè)～2個(gè)根結(jié)的為1級(jí)；3個(gè)～10個(gè)根結(jié)的為2級(jí)；11個(gè)～30個(gè)根結(jié)的為3級(jí)；31個(gè)～100個(gè)根結(jié)的為4級(jí)，100個(gè)以上的根結(jié)為5級(jí)。0、1級(jí)為不親和，用“-”表示；2級(jí)～5級(jí)為親和，用“+”表示。根據(jù)線蟲(chóng)在上述寄主上的表現(xiàn)確定南方根結(jié)線蟲(chóng)的小種[7-9]。用亮藍(lán)對(duì)根上卵塊染色和用NaClO提取根內(nèi)卵，方法參照Hussey和Barker等[10]。

2結(jié)果與分析

2.1PCR技術(shù)對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)種的鑒定

利用引物F194/F195對(duì)大慶線蟲(chóng)、已知的北方和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的rDNA-IGS進(jìn)行PCR擴(kuò)增比較，凝膠電泳結(jié)果顯示3個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)群體均擴(kuò)增出約750 bp的電泳條帶(圖1A)，說(shuō)明大慶線蟲(chóng)是根結(jié)線蟲(chóng)屬[2]。利用北方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)及象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)的特異性引物均未擴(kuò)增出電泳條帶(圖1B)，說(shuō)明該線蟲(chóng)群體可能僅為單一的南方根結(jié)線蟲(chóng)群體。而且PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，采自大慶的兩個(gè)線蟲(chóng)DNA樣品持續(xù)擴(kuò)增出片段大小約為399 bp的南方根結(jié)線蟲(chóng)特異性條帶(圖1B和圖1C)，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道南方根結(jié)線蟲(chóng)的分子鑒定結(jié)果一致[3]。來(lái)自爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)群體和北方根結(jié)線蟲(chóng)(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)群體的DNA樣品分別經(jīng)爪哇根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)引物PCR擴(kuò)增后，分別獲得了約517 bp的爪哇根結(jié)線蟲(chóng)及610 bp的北方根結(jié)線蟲(chóng)的特異性條帶(圖1C)，進(jìn)一步說(shuō)明了該研究方法的可靠性。

2.2鑒別寄主法對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)小種的鑒定

以上PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示大慶市的根結(jié)線蟲(chóng)群體為南方根結(jié)線蟲(chóng)。因?yàn)椴煌N根結(jié)線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)的4個(gè)生理小種對(duì)同一寄主的致病性存在差異，所以利用鑒別寄主法對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的小種作進(jìn)一步鑒定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，番茄對(duì)大慶線蟲(chóng)的侵染非常敏感，根表有大量蟲(chóng)癭和卵塊形成，而在煙草和棉花上并未發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)癭(圖2)，僅在煙草上提取到很少量的卵，棉花根上沒(méi)有提取到卵(表2)，說(shuō)明大慶市南方根結(jié)線蟲(chóng)群體為1號(hào)小種，參照Barker等[9]建立的不同種根結(jié)線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)不同小種對(duì)一些植物反應(yīng)的鑒定系統(tǒng)。同時(shí)，北方根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)在番茄、煙草和棉花上的反應(yīng)與Barker等的鑒定系統(tǒng)完全相符。

表2　不同寄主植物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)小種的測(cè)定結(jié)果

3結(jié)論與討論

研究調(diào)查了大慶市棚室內(nèi)番茄和黃瓜上主要根結(jié)線蟲(chóng)種群，采集樣品經(jīng)單卵塊純化培養(yǎng)后，利用PCR技術(shù)和鑒別寄主法對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)純化群體進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果表明，大慶市棚室內(nèi)番茄和黃瓜上根結(jié)線蟲(chóng)種群為南方根結(jié)線蟲(chóng)，并且是1號(hào)生理小種。國(guó)內(nèi)外研究顯示，廣泛分布在世界各地的南方根結(jié)線蟲(chóng)有4個(gè)小種，其中1號(hào)小種為優(yōu)勢(shì)小種，2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)小種只分布于有限地區(qū)。廖金玲等[8]報(bào)道南方根結(jié)線蟲(chóng)幾乎在全國(guó)均有分布。楊寶君[11]對(duì)我國(guó)不同地區(qū)15種植物根結(jié)線蟲(chóng)病害病原調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲(chóng)只有1號(hào)小種；喻盛甫等[12]對(duì)云南植物根結(jié)線蟲(chóng)調(diào)查結(jié)果顯示南方根結(jié)線蟲(chóng)1號(hào)小種為優(yōu)勢(shì)種，2號(hào)和3號(hào)小種僅有零星分布。研究利用鑒別寄主的方法鑒定大慶市大棚內(nèi)的南方根結(jié)線蟲(chóng)為1號(hào)小種，這與前人研究結(jié)論相符。研究的樣品采集于黑龍江省大慶市大棚溫室中，其氣候條件不同于露地，由于大棚內(nèi)每年種植兩茬蔬菜，室內(nèi)溫度和濕度較大，適合需要較高溫度的南方根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)生和繁殖。于秋菊等[13]采用形態(tài)學(xué)方法鑒定大慶市溫室內(nèi)的根結(jié)線蟲(chóng)為南方根結(jié)線蟲(chóng)。近年來(lái)，運(yùn)用PCR技術(shù)是植物根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定的主要手段，同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)及同工酶分析等方法，為病原區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)提供了便利。本試驗(yàn)采用根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物對(duì)大慶市大棚溫室中根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行PCR鑒定，在形態(tài)學(xué)鑒定和鑒別寄主方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)了大慶市大棚溫室中根結(jié)線蟲(chóng)為南方根結(jié)線蟲(chóng)。本研究結(jié)果對(duì)于大慶市大棚內(nèi)蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病害選育抗病作物品種和采用抗病作物輪作防治根結(jié)線蟲(chóng)具有重要意義，為制定該病害可持續(xù)防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

圖1　根結(jié)線蟲(chóng)樣品內(nèi)參基因的PCR產(chǎn)物和特異性引物擴(kuò)增種群DNA的PCR產(chǎn)物Fig.1　Electrophoresis patterns of PCR amplified Meloidogyne populations with specific primersA：3個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)樣品rDNA-IGS序列的PCR產(chǎn)物(包括大慶線蟲(chóng)樣品、北方根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng))，Products of PCR amplified rDNA-IGS fragments using DNA samples of Meloidogyne spp.(Daqing isolate,M.hapla and M. javanica);B：特異性引物擴(kuò)增大慶線蟲(chóng)樣品DNA的PCR 產(chǎn)物，Species-specific PCR products using DNA samples of Meloidogyne spp. from Daqing.泳道1: rDNA-IGS序列的PCR 產(chǎn)物 Products of PCR amplified rDNA-IGS fragments using the primer set F194/F195；泳道2：北方根結(jié)線蟲(chóng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物 Amplification products from reactions using the primer set Fhap/Rhap for M.hapla；泳道3：爪哇根結(jié)線蟲(chóng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物 Amplification products from reactions using the primer set Fjav/Rjav for M.javanica；泳道4：南方根結(jié)線蟲(chóng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物 Amplification products from reactions using the primer set Finc/Rinc for M.incognita；泳道5：花生根結(jié)線蟲(chóng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物 Amplification products from reactions using the primer set Fare/Rare for M. arenaria；泳道6：象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物 Amplification products from reactions using the primer set Fent/Rent for M. enterolobii;C:特異性引物擴(kuò)增供試根結(jié)線蟲(chóng)種群DNA的PCR 產(chǎn)物，Species-specific PCR products using DNA samples of Meloidogyne spp..泳道1和2：用爪哇根結(jié)線蟲(chóng)引物擴(kuò)增華南農(nóng)大爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的產(chǎn)物 Lines 1 and 2 were PCR products of population of M.javanica from South China Agricultural University with M.javanica primer(517 bp)；泳道3和4：用南方根結(jié)線蟲(chóng)引物擴(kuò)增大慶根結(jié)線蟲(chóng)的產(chǎn)物 Lines 3 and 4 were PCR products of population of RKN from Daqing with M.incognita primer(399 bp)；泳道5和6：用北方根結(jié)線蟲(chóng)引物擴(kuò)增沈陽(yáng)農(nóng)大北方根結(jié)線蟲(chóng)的產(chǎn)物(基因片段610 bp)Lines 5 and 6 were PCR products of population of M.hapla from Shenyang Agricultural University with M.hapla primer(610 bp)。M：Marker DL2000

圖2　大慶的南方根結(jié)線蟲(chóng)在不同寄主上的表型反應(yīng)Fig.2　Phenotypic response of M.incognita from Daqing on different hosts A:在番茄上的表型反應(yīng)(品種為中蔬4號(hào)，藍(lán)色為卵塊) Phenotypic response on tomato (Zhongshu4,Blue points indicated egg masses)；B:在煙草上的表型反應(yīng)(品種為NC95)Phenotypic response on tobacco (NC95)；C:在棉花上的表型反應(yīng)(品種為泗棉3號(hào))Phenotypic response on cotton (Simian3)

致謝：感謝黑龍江省大慶市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心金輝老師提供的番茄根和黃瓜根樣品。

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Identification of Species and Races of Root-knot Nematodes in Greenhouse from Daqing City in Heilongjiang Province

LI Chunjie,HU Yanfeng,WANG Congli

(KeyLaboratoryofMollisolsAgroecology,NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,CAS,Harbin150081,China)

Abstract：To identify species and races of root-knot nematodes isolated from tomato and cucumber plants in the greenhouse of Daqing District,Heilongjing Province,PCR technology and differential host test were used. The results indicated that the root-knot nematode was only southern root-knot nematodes Meloidogyne incognita,and its race 1.

Key words：root-knot nematodes；species and race identification；PCR technology；differential host test；Heilongjiang province

中圖分類(lèi)號(hào)：S154.38+6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

第一作者簡(jiǎn)介：李春杰(1976-)，女，黑龍江依安人，博士，副研究員，主要研究方向?yàn)樽魑锊∠x(chóng)害生物生態(tài)控制.通訊作者：王從麗(1973-)，女，河南唐河人，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锛纳€蟲(chóng)病害發(fā)生機(jī)理和防治.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31471749)和中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”項(xiàng)目.

收稿日期：2015-10-28；修回日期：2015-11-04.

文章編號(hào)：2095-2961(2016)02 -0105-05

doi:10.11689/j.issn.2095-2961.2016.02.006