姚海榮　曾炳山　范春節(jié)　裘珍飛　郭光生　覃偉權　閻偉

摘 要 WRKY家族為植物所特有，參與調控植物逆境脅迫、生長發(fā)育和衰老等生物學過程。為了獲得WRKY70同源基因在桉樹響應脅迫中的作用和功能，克隆巨桉（Eucalyptus grandis）中的EgrWRKY70基因，通過生物信息學分析和qRT-PCR進行功能的初步鑒定。結果表明，EgrWRKY70基因編碼321個氨基酸，蛋白分子量為36.18 ku，只有一個WRKY結構域，屬于WRKY轉錄因子III a類成員。同時，EgrWRKY70與麻風樹的JcuWRKY70的親緣關系最近，其氨基酸序列相似性達到58.2%。半定量RT-PCR分析表明，EgrWRKY70主要在巨桉葉片、根和花中表達，而在莖部表達量較低。實時定量qRT-PCR分析顯示：EgrWRKY70基因在低溫和鹽脅迫下，表達量快速升高然后下降；在鹽脅迫下EgrWRKY70基因表達仍然維持在較高水平；在油菜素內酯和水楊酸處理時，EgrWRKY70基因能夠快速的響應，使用茉莉酸甲酯處理時其表達量沒有發(fā)生明顯的變化。由此表明，EgrWRKY70能夠通過不同的響應方式參與桉樹生物和非生物脅迫的應答。

關鍵詞 巨桉；EgrWRKY70；基因克??；差異表達

中圖分類號 S792.39 文獻標識碼 A

Abstract The plant-specific WRKY transcription factor family appears to be involved in the regulation of various biological processes including response to stresses， growth and development， and senescence. In order to identify the function response to stress of WRKY70 in Eucalyptus grandis， EgrWRKY70 was cloned and analyzed by using reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）and real time quantitative PCR（qRT-PCR）. EgrWRKY70 encoded a predict protein of 321 amino acids. The theoretical molecular weight of EgrWRKY70 was 36.18 ku with pI of 5.28， unstability index of 63.67. EgrWRKY70 contained a conserved WRKY domain and belonged to group IIIa. The results of multiple alignments and phylogenetic analysis revealed that EgrWRKY70 closed to JcuWRKY70 with 58.2% similarity. The expression of EgrWRKY70 was detected in flowers， leaves and roots by semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction， and EgrWRKY70 did not nearly expressed in stem including xylem and phloem. Expression of EgrWRKY70 increased firstly and then decreased with the duration of the treatment of salt and cold. However， the EgrWRKY70 expression maintained at a high level under salt stress. Besides， after the treatments of salicylic acid and brassinolide， the levels of EgrWRKY70 expression increased rapidly and then decreased. The expression of EgrWRKY70 almost did not changed after the treatment of methyl jasmonate. These results suggested that EgrWRKY70 may have relationship with biotic and abiotic stress responses in E. grandis.

Key words Eucalyptus grandis， EgrWRKY70； Gene cloning； Gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.016

WRKY家族是植物所特有的轉錄因子，含有一段由60個氨基酸組成的高度保守的WRKY結構域，N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸殘基，C端具有鋅指結構，其結構域可以與具有（T）TGAC（C/T）序列的W-box順式作用元件的靶基因特異結合，從而調控下游基因的表達。WRKY家族成員眾多，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在74個WRKY家族基因，水稻（Oryza sativa）中預測發(fā)現100多個WRKY成員[1-3]。近來，采用分子生物學和正向遺傳學突變體篩選等方法鑒定出WRKY家族成員的基因功能，發(fā)現其參與到調控植物生長發(fā)育[4-5]、衰老[6]、代謝調控[7]等生物學過程，除此之外WRKY家族基因在防御生物和非生物脅迫[8-10]及其過程中的信號轉導[11]中均起到重要作用。其中WRKY70可以與其結構類似的WRKY46、WRKY53協(xié)同和激素水楊酸（Salicylic acid，SA）、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）相互作用，在假單胞桿菌和黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的抗性中起到正調控作用[12-14]。而其在木本植物中對于這些病菌的感染作用是否具有相同的調控作用尚未進行研究。

桉樹（Eucalyptus）是桃金娘科（Myrtaceae）桉樹屬（Eucalyptus）的總稱，具有速生豐產、適應性廣等特點，在熱帶和亞熱帶地區(qū)栽培廣泛，已成為華南地區(qū)第一大造林樹種。但隨著種植面積的擴大，桉樹病害發(fā)生面積和分布范圍也有擴大的趨勢， 其中焦枯病（Cylindrocladium quinqueseptatum）和青枯病（Pseudomonas solanacearum）的發(fā)病率最高，造成重大的經濟損失。若能從桉樹中克隆一些抗逆轉錄因子基因導入到桉樹栽培品種中，獲得抗性較強的桉樹新品種，將為解決桉樹的病蟲害提供一種新模式，因此，相關基因的篩選和功能鑒定變得尤為重要。而在模式植物擬南芥中證實WRKY70在響應逆境脅迫中起到重要的作用，但在木本植物中尚未見相關報道。為了鑒定桉樹中的WRKY70同源基因是否具有相同或相似的耐脅迫功能，本研究以巨桉（Eucalyptus grandis）為材料進行了WRKY70同源基因的克隆，同時使用實時定量PCR技術對其在低溫、高鹽逆境脅迫和油菜素內酯（Brassinolide，BR）、MeJA、SA處理下的時空表達模式進行了初步分析，為下一步的功能鑒定奠定基礎，以期為桉樹抗逆分子育種提供候選基因和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料及處理 組織表達分析所用材料為巨桉無性系GL1，花和3年生木質部和韌皮部+形成層，材料取自廣東肇慶市四會貞山苗圃3年生桉樹GL1，其中木質部和韌皮部+形成層部位取1.5 m處。桉樹GL1材料為組培苗轉移到溫室6個月，苗高為1 m左右，取木質部、韌皮部+形成層、幼嫩葉片、成熟葉片、根器官?；蚩寺〔牧弦曰ㄆ鞴偬崛〉腸DNA為模板。

對于不同處理的樣品，以巨桉無性系GL1為材料，30～40 cm高，生長狀況良好植株。分別采用0.2 μmol/L BR、0.1 mmol/L MeJA、0.1 mmol/L SA噴施處理，分別在0，1，6，24，168 h后取葉片。鹽處理采用200 mmol/L NaCl灌根處理，分別在0，1，6，24，168 h取葉片。冷處理采用在4 ℃條件下2，4，24，48 h，具體處理參見魏曉玲等方法[15]。每個處理5株，每個處理3個重復。統(tǒng)一采取頂端向下4～6片葉片，立即放于液氮中速凍，用于RNA提取。

1.1.2 試劑和引物 大腸桿菌（Escherichia coli） Trans1-T1（DH5α）感受態(tài)，pBlunt simple-T1 Cloning Kit 購自北京全式金生物技術有限公司；Q5 High-Fidelity PCR Kit，Quick-Load Taq 2X Master Mix購自NEB；QIAquick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、Plasmid Mini Prep質粒提取試劑盒、DNase I試劑盒購自QIAGEN。引物合成由上海英俊合成（表1），DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈合成 采取約0.1 g的桉樹材料放在凍存管中，快速放入液氮中凍存。采用艾德萊德植物RNA提取試劑盒說明書進行總RNA提取，然后經過DNase I消化基因組DNA，得到純化的總RNA。經過NanoDrop-2000檢測質量和濃度。取1 μg檢測合格的總RNA，采用Invitrogen公司的SuperscriptIII反轉錄試劑盒進行cDNA合成。

1.2.2 基因克隆和測序 基于桉樹基因組測序的結果，以模式植物擬南芥的WRKY70，進行比對分析，篩選出與之同源巨桉WRKY70。該基因序列長度為1 372 bp，包含完整ORF編碼框（966 bp），以此序列設計引物用于EgrWRKY70基因的全長cDNA 擴增。由于在半定量分析時發(fā)現EgrWRKY70在花組織中表達量較高，因此以巨桉花組織總RNA的反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增完成后用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，回收目的片段條帶，連接克隆載體pEASY blunt-T1，并轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，過夜生長。挑取單菌進行克隆，搖菌，并進行菌液PCR檢測，確認條帶大小無誤后取菌液送上海生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析及進化樹構建 利用Expasy 數據庫中的在線分析軟件ProtParam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）分析并預測巨桉WRKY70蛋白的理化性質，包括該蛋白的氨基酸成分，相對分子量，是否能穩(wěn)定存在等。用SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_

sopma.pl）進行二級結構預測。用swiss-model分析軟件（http：//swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html）進行三維空間結構預測。蛋白質無序化分析軟件為FoldIndex（http：//bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex）[16]。蛋白質跨膜區(qū)預測軟件為TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）。蛋白質模體分析軟件為MEME（Multiple EM for Motif Elicitation，MEME，http：//meme.sdsc.edu/）。蛋白質結構域分析使用在線軟件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）ko3.1，使用在線軟件TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對蛋白質進行亞細胞定位[17]。通過NCBI的BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）查找不同植物的同源序列，對不同植物的WRKY70蛋白序列與巨桉WRKY70蛋白序列進行多序列比對，采用Javaview中的ClustalW Multiple Sequence Alignment程序。進化樹采用Gblock多重比對下的平均距離樹（Average Distance Tree）來表示。

1.2.4 基因差異表達分析 利用半定量PCR分析EgrWRKY70基因在不同組織中的表達情況，選擇EgrACT在不同組織中為參照基因[18]。利用Primer 5.0設計EgrWRKY70基因的半定量引物。半定量PCR反應分別以3年生桉樹木質部、1年生桉樹莖、花、3年生桉樹韌皮部、1年生桉樹木質部、幼葉、成熟葉、根組織的cDNA為模板，反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)。將PCR產物與染液（MAESTROGEN，USA）按照10 ∶ 1比例混合后于2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

對于不同處理的EgrWRKY70基因表達分析，利用ABI7500熒光定量分析儀，采用SYBR Premix ExTaq II（Takara）試劑進行分析。cDNA樣品稀釋20倍，程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。溶解曲線程序為：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。使用EgrACT為參照基因，所有試驗為3個生物學重復，每個重復至少3個定量重復分析。

2 結果與分析

2.1 EgrWRKY70基因的克隆及其在不同組織中的表達分析

通過電子克?。‥ucgr.G03145）和RT-PCR方法，從巨桉GL1花器官中克隆到EgrWRKY70基因。測序結果表明，其核苷酸序列與電子克隆序列一致，經過BLAST比對，該序列編碼的氨基酸中含有一個典型的WRKY結構域，位于131-193氨基酸之間，屬于WRKY家族1類，將該基因命名為EgrWRKY70。其ORF長度為966 bp，編碼321個氨基酸序列。采用生物信息學分析得到其分子量為36.18 ku，理論等電點為5.28，不穩(wěn)定系數為63.67，說明這個蛋白是不穩(wěn)定的；脂溶性系數為54.08，表現為脂溶性蛋白；總親水性系數為-0.862，為親水性蛋白。蛋白質二級結構分析表明，無規(guī)則卷曲是該蛋白的主要組成元件，占所有結構的71.65%，另外α-螺旋占蛋白結構的17.13%，β-折疊為11.21%。亞細胞定位預測表明其定位在細胞核。信號肽序列分析表明其沒有信號肽存在。蛋白無序性分析表明，其蛋白無性系為-0.050，存在4個無序區(qū)，分別為1～38、79～234、255～281、290～321，最長無序區(qū)長度為165個氨基酸（圖1-A）。

通過半定量PCR分析其在不同組織中的表達發(fā)現，EgrWRKY70主要在葉（包括嫩葉和成熟葉）、花和根中表達（圖1-B），因此在后面的實驗中選擇葉片進行RNA提取和定量表達分析。除此之外，在3年生韌皮部有少量表達，而在3年生木質部和1年生莖部（包括木質部、韌皮部和皮層）沒有或幾乎看不到表達。說明EgrWRKY70表達具有組織特異性。

2.2 多重比較和進化樹分析

通過與其他物種WRKY家族蛋白進行多重序列比對分析表明，所有植物中的WRKY70家族都只有一個保守的氨基酸WRKY序列，屬于WRKY轉錄因子III a類成員。利用NCBI中的Blast程序對EgrWRKY70編碼蛋白與其它植物中WRKY70蛋白進行同源性分析（圖2），結果表明蛋白EgrWRKY70與擬南芥、大豆、楊樹、麻瘋樹、可可等WRKY70蛋白同源性為39%～58%，同時這些蛋白都具有5個明顯的保守結構域。將不同植物的WRKY70蛋白聚類分析表明，桉樹與麻風樹（Jatroph acurcas）親緣關系最近，與毛果楊（Populus trichocarpa）、蓖麻（Ricinus communis）、可可（Theobron macacao）、棉花（Gossypium raimondii）、桃樹（Prunus persicappa）中的WRKY70具有較近的親源關系，聚類在一起，而作為草本植物的擬南芥與其他木本植物的WRKY70親緣關系較遠（圖3）。進一步利用網站Expasy中Swiss Model程序同源建模，推測該蛋白的三維結構模型如圖4所示。其結構與擬南芥的WRKY70蛋白類似，可以推知EgrWRKY70蛋白與擬南芥WRKY70蛋白有相似的生物學功能。

2.3 基因對不同處理的響應

從圖5可以看到，在BR、SA、MeJA處理后，EgrWRKY70基因通過表達量明顯提高快速響應外源激素的變化，其中SA處理1 h時，EgrWRKY70基因表達量約是對照的21.81倍，而BR和MeJA處理6 h時，EgrWRKY70基因的轉錄水平分別為對照的10.55和3.03倍（圖5-A、B、C）。而在經過24 h或168 h后，EgrWRKY70基因的表達量恢復到正常水平。表明EgrWRKY70能夠快速響應BR、SA、MeJA外源激素的處理。

盡管如此，EgrWRKY70應對非生物脅迫時呈現出不同的調控方式。本研究中，在鹽處理1 h時，EgrWRKY70能夠對鹽脅迫做出快速的反應，其表達量達到對照的14.35倍（圖5-D）。除此之外，隨著時間延長，EgrWRKY70基因表達量略微降低，但與對照相比，其表達量仍然維持在一個較高的水平。同時在長期處理（168 h）時EgrWRKY70基因的表達量達到對照的28.26倍。說明EgrWRKY70在短期和長期鹽脅迫響應表達量一直維持著較高的水平來調控巨桉應對鹽脅迫。在冷處理響應中EgrWRKY70則表現出快速響應，在2 h和4 h達到對照表達量的7.08和3.40倍，然后表達量恢復到正常水平（圖5-E）。這些都說明EgrWRKY70在對于不同的逆境脅迫存在著不同的響應方式，這些不同的響應方式也意味著桉樹在不同的逆境條件下EgrWRKY70的調控途徑以及調控機制存在著差異。

3 討論與結論

在早期的研究中已發(fā)現水楊酸、油菜素內酯、茉莉酸甲酯等生長調節(jié)劑在應對生物脅迫及非生物脅迫反應的重要信號分子，能誘導多種植物對生物和非生物脅迫產生持續(xù)抗性，減緩植物對包括病原菌侵染等多種逆境脅迫的傷害[19-22]。WRKY70是WRKY轉錄因子III a類成員，在生物脅迫過程中參與到植物防御過程，WRKY70突變體植株表現出對白粉菌（Erysiphe cichoracearum）和霜霉病菌（Hyaloperonospora parasitica）更加敏感，而值得注意的是更加耐黑斑病菌（Alternaria brassicicola）[14]。與之相反，過表達WRKY70基因會提高植物對黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的抗性，但會降低植物對白粉菌的抗性[14]。在此過程中會引起幾個JA響應基因的抑制，而部分通過NPR1來執(zhí)行，表明WRKY70在調控依賴SA和JA防御途徑中的平衡作用中起到重要作用[8，14]。除此之外，AtWRKY70作用于防御相關的活性氧中間物和SA下游，作為基本防御機制的主要成員，被RPP4或RPP7引發(fā)，參與到RPP4調控的防御[12]。而突變體wrky46wrky70和wrky46wrky70wrky53表現出對病菌的敏感性增加，病害表型更加明顯。說明WRKY70與其結構相似且功能冗余的同源基因WRKY46、WRKY53共同調控對丁香假單胞桿菌的基礎防御[13]。在本研究中通過外施水楊酸、油菜素內酯、茉莉酸甲酯到桉樹葉片發(fā)現EgrWRKY70呈現出不同的表達變化，其中外施水楊酸和油菜素內酯時EgrWRKY70的表達量快速升高，尤其是在外施水楊酸時EgrWRKY70基因在1 h后的表達量大幅度增加。而在前期的研究中未發(fā)現通過外施水楊酸能夠誘導桉樹對青枯菌的抗性[23-24]，這也預示著EgrWRKY70可能會在誘導桉樹青枯病抗性中起到正調控作用。值得注意的是在茉莉酸甲酯外施處理時，EgrWRKY70表達量變化較小甚至沒有變化，這可能是與擬南芥中WRKY70的作用方式不同。同時，在本研究中還發(fā)現其在鹽脅迫和冷脅迫中能過快速的響應和表達，尤其在鹽脅迫時能夠持續(xù)的表達，說明EgrWRKY70可能在非生物脅迫中也起到重要的調控作用。這與擬南芥中報道的WRKY70和WRKY54響應滲透壓脅迫時響應類似[25]，可能是WRKY70主要響應鹽脅迫中的滲透壓脅迫。

除此之外，AthWRKY70在葉片自然衰老過程中表達量增加，在葉片衰老前達到最大值。而其功能缺失會促進正常葉片的衰老以及黑暗誘導下葉片的衰老，說明擬南芥WRKY70是衰老的負調控因子。而在其突變體中發(fā)現受SA、JA、ET調控的防御標志性基因PR1、PR2、PR3、COR1、PDF1.2的表達受到抑制，說明WRKY70與激素的調控存在著協(xié)同作用[6]。而且WRKY70與WRKY54、WRKY30共同作為葉片衰老的負調控因子，參與到整合植物內部環(huán)境信號來調節(jié)葉片衰老的開始和衰老過程的一個調控網絡中[26]。這些結果都說明WRKY70可能參與到多個生物學過程，因此在下一步的研究中，需要將EgrWRKY70轉入擬南芥或桉樹中，獲得相應的轉基因植株，通過表型以及對生物和非生物脅迫的響應分析，獲得其在桉樹中的功能，同時獲得具有抗性的轉基因桉樹新品種。

參考文獻

[1] Rengasamy Ramamoorthy S Y， Nadimuthu Kumar J. Prasanna Nori Venkatesh and Srinivasan Ramachandran. A Comprehensive Transcriptional Profiling of the WRKY Gene Family in Rice Under Various Abiotic and Phytohormone Treatments[J]. Plant Cell Physiol， 2008， 49： 865-879.

[2] Ulker B， Somssich I E. WRKY transcription factors： from DNA binding towards biological function[J]. Current opinion in plant biology， 2004， 7： 491-498.

[3] Wang Y Z. The WRKY transcription factor superfamily： its origin in eukaryotes and expansion in plants[J]. BMC Evolutionary Biology， 2005， 5： 1-3.

[4] Guillaumie S， Mzid R， Méchin V. et al. The grapevine transcription factor WRKY2 influences the lignin pathway and xylem velopment in tobacco[J]. Plant Molecular Biology， 2009， 72： 215-234.

[5] Huanzhong Wang， Jin Nakashima， Michael G. Mutation of WRKY transcription factors initiates pith secondary wall formation and increases stem biomass in dicotyledonous plants[J]. PNAS， 2010， 107： 22 338-22 343.

[6] Ulker B， Shahid Mukhtar M， Somssich I E. The WRKY70 transcription factor of Arabidopsis influences both the plant senescence and defense signaling pathways[J]. Planta， 2007， 226： 125-137.

[7] Xu Y H， Wang J W， Wang S， et al. Characterization of GaWRKY1， a Cotton Transcription Factor That Regulates the Sesquiterpene Synthase Gene（+）-δ-Cadinene Synthase-A[J]. Plant Physiology， 2004， 135： 507-515.

[8] Li J， Brader G， Kariola T， et al. WRKY70 modulates the selection of signaling pathways in plant defense[J]. The Plant Journal， 2006， 46： 477-491.

[9] Ligang Chen L Z， Diqiu Yu. Wounding-Induced WRKY8 Is Involved in Basal Defense in Arabidopsis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2010， 23： 558-565.

[10] Vanderauwera S， Vandenbroucke K， Inze A， et al. AtWRKY15 perturbation abolishes the mitochondrial stress response that steers osmotic stress tolerance in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2012， 109： 20 113-20 118.

[11] Wan J， Zhang S， Stacey G. Activation of a mitogen‐activated protein kinase pathway in Arabidopsis by chitin[J]. Molecular Plant Pathology， 2004， 5： 125-135.

[12] Colleen Knoth J R， Jeffery L. Arabidopsis WRKY70 Is Required for Full RPP4-Mediated Disease Resistance and Basal Defense Against Hyaloperonospora parasitica[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2007， 20： 120-128.

[13] Hu Y， Dong， Q， Yu D. Arabidopsis WRKY46 coordinates with WRKY70 and WRKY53 in basal resistance against pathogen Pseudomonas syringae[J]. Plant Science， 2012， 185-186： 288-297.

[14] Li J. The WRKY70 Transcription Factor： A Node of Convergence for Jasmonate-Mediated and Salicylate-Mediated Signals in Plant Defense[J]. The Plant Cell Online， 2004， 16： 319-331.

[15] 魏曉玲， 程龍軍， 竇錦青， 等. 巨桉EgrDREB2 A基因結構及表達特性分析[J]. 林業(yè)科學， 2015， 51： 80-89.

[16] Prilusky J， Felder C E， Zeev-Ben-Mordehai T， et al. FoldIndex： a simple tool to predict whether a given protein sequence is intrinsically unfolded[J]. Bioinformatics， 2005， 21： 3 435-3 438.

[17] Emanuelsson O， Nielsen H， Brunak S， et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology， 2000， 300： 1 005-1 016.

[18] Luisa Abruzzi de Oliveira M l C B， Fernanda Macedo Bastolla， Sandro da Silva Camargo， et al. Reference Genes for the Normalization of Gene Expression in Eucalyptus Species[J]. Plant Cell Physiol， 2012， 53： 405-422.

[19] Bajguz A， Hayat S. Effects of brassinosteroids on the plant responses to environmental stresses[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2009， 47： 1-8.

[20] Dreher K， Callis J. Ubiquitin， hormones and biotic stress in plants[J]. Annals of Botany， 2007， 99： 787-822.

[21] 江厚龍， 李 鵬， 李鈉鉀， 等. 外源誘抗劑對煙草青枯病的誘抗效果研究[J]. 中國農學通報， 2014， 30： 286-290.

[22] 向妙蓮， 陳 明， 宋水林， 等. 水楊酸誘導辣椒抗疫病的作用研究[J]. 生物災害科學， 2012， 2： 9.

[23] 冉隆賢， 谷文眾， 吳光金. 水楊酸誘導桉樹抗青枯病的作用及相關酶活性變化[J]. 林業(yè)科學研究， 2004， 17： 12-18.

[24] 向妙蓮， 冉隆賢， 周 斌. 水楊酸處理對桉樹抗青枯病誘導作用研究[J]. 江西農業(yè)大學學報， 2007， 28： 868-871.

[25] Li J， Besseau S， Toronen P， et al. Defense-related transcription factors WRKY70 and WRKY54 modulate osmotic stress tolerance by regulating stomatal aperture in Arabidopsis[J]. New Phytologist， 2013， 200： 457-472.

[26] Besseau S， Li J， Palva E T. WRKY54 and WRKY70 co-operate as negative regulators of leaf senescence in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63： 2 667-2 679.