陳美娟 陳東陽 謝龍 陸振萍 楊蒙蒙 莫麗芬 盧克煥 陸陽清

摘要：【目的】探究受體胚齡對雞原始生殖細胞（Primordial germ cell，PGC）移植后歸巢的影響，確定最佳回注時間窗口，為提高轉(zhuǎn)基因雞的生產(chǎn)效率提供參考依據(jù)?！痉椒ā繌膹V西黃羽雞胚分離獲得PGC，體外培養(yǎng)并進行轉(zhuǎn)基因操作后，移植回注到不同胚齡的受體雞胚中，移植5 d后分離性腺拍照觀察，對比受體雞胚孵育至14HH～17HH時對PGC遷移歸巢到性腺的影響?！窘Y(jié)果】分別在14HH～17HH胚齡時移植回注PGC，移植5 d后的雞胚死亡率為30.0%～

60.9%，但不同移植胚齡間的差異不顯著（P>0.05）。根據(jù)雞胚性腺中的GFP陽性細胞數(shù)可劃分為6個等級（I～VI），且隨著移植胚齡的增加，PGC遷移效率呈下降趨勢。14HH胚齡移植的雞胚性腺GFP陽性細胞集中在V級（40.0%），15HH胚齡移植的集中在III級（42.1%），16HH和17HH胚齡移植的則集中在II級（45.4%和54.5%），GFP陽性細胞含量最高等級（VI級）僅出現(xiàn)在14HH胚齡移植的雞胚性腺中?！窘Y(jié)論】隨著受體胚齡的增加，PGC遷移效率呈下降趨勢，但鑒于實際操作的難易程度，確定PGC移植回注的最佳時間窗口為14HH雞胚（孵育50 h）。

關(guān)鍵詞： 雞；原始生殖細胞；移植胚齡；遷移效率；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號： S831 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-1014-05

0 引言

【研究意義】禽類在畜牧業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，且作為模型動物已廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究。相對于其他哺乳動物，禽類具有獨特的優(yōu)勢，如繁殖周期短、個體小、飼養(yǎng)成本低、胚胎易于操作等（徐國正等，2007；李俊營等，2014；吳雙等，2014）。由于禽類胚胎發(fā)育模式的特殊性，其受精卵從體內(nèi)產(chǎn)下時已是一個含有幾萬個細胞的早期胚胎，導(dǎo)致禽類受精卵轉(zhuǎn)基因技術(shù)受到限制。原始生殖細胞（Primordial germ cell，PGC）作為配子的前體細胞，能將遺傳信息傳遞給下一代，若能分離培養(yǎng)PGC并進行基因操作，移植生成的精子或卵子將可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物?！厩叭搜芯窟M展】近年來，許多有關(guān)PGC起源及遷移的研究證實禽類PGC具有獨特的遷移方式。Nakamura等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，雞PGC起源于上胚層，孵育至10HH時集中于頭部，11HH開始進入血脈系統(tǒng)，14HH時在血液中達到峰值，然后向生殖脊遷移，至17HH時歸巢生殖脊處。李碧春等（2010）研究證實，雞PGC在發(fā)育過程中以血液系統(tǒng)為載體從生殖新月區(qū)遷移到性腺。禽類PGC的遷移規(guī)律為分離PGC體外培養(yǎng)并進行基因操作提供了依據(jù)，同時使得利用PGC生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因禽類具有可行性。根據(jù)PGC在雞胚體內(nèi)的遷移及分布情況，Shiue等（2009）從孵育5.5 d的雞胚性腺中分離獲得性腺PGC，并在體外進行長期培養(yǎng)；Tonus等（2014）從孵育至13HH～18HH的雞胚血液中成功分離獲得PGC。PGC經(jīng)過體外培養(yǎng)及基因修飾后，仍保持其生物學(xué)特性，回注到雞胚血脈系統(tǒng)后可遷移到性腺并發(fā)育成功能性配子，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代（van de Lavoir et al.，2006）?！颈狙芯壳腥朦c】在利用PGC為載體進行家禽基因操作過程中，由于PGC遷移僅發(fā)生在特定的時間窗口，因而受體胚齡將影響PGC遷移及生殖系嵌合體雞的制備效率，但至今鮮見有關(guān)受體胚齡對雞PGC移植歸巢影響的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探析廣西黃羽雞胚孵育至14HH～17HH時回注PGC細胞的效果，確定最佳的PGC回注時間窗口，為提高轉(zhuǎn)基因雞的生產(chǎn)效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗種蛋來源及孵育

種蛋為廣西黃羽雞蛋，由廣西富鳳農(nóng)貿(mào)有限公司提供。雞胚孵育溫度37.8 ℃，相對濕度60%，孵育期按Hamburger和Hamiltion（1992）標(biāo)準(zhǔn)進行劃分。

1. 2 細胞來源及培養(yǎng)

從孵育至14HH～15HH的黃羽雞胚血液中分離獲得PGC。PGC接種至經(jīng)γ射線處理的MEF飼養(yǎng)層上，用CKO培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱參數(shù)37 ℃、5% CO2。CKO培養(yǎng)液中含66% KO-DMEM、20% BRL培養(yǎng)液、7.5%特級胎牛血清（FBS）、2.5% Chicken Serum、1×GS Nucleoside Supplement、1×GlutaMAXTM、1×Anti-anti、0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol、4 ng/mL Human recombinant FGF。培養(yǎng)細胞每2 d半量換液1次，每4～5 d傳代1次。

1. 3 轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）基因及篩選

PiggyBac轉(zhuǎn)座子內(nèi)含GFP基因及嘌呤霉素篩選基因。轉(zhuǎn)染前將PGC轉(zhuǎn)移到24孔板中，然后按照Lipofectamine■ LTX & PLUSTM Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后收集細胞，離心，重懸后接種到新的飼養(yǎng)層上，加入新鮮CKO培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長滿后加入1 μg/mL嘌呤霉素進行篩選，連續(xù)篩選3代即獲得穩(wěn)定表達GFP基因的細胞系。

1. 4 雞胚胚期確定

雞胚分別孵育50、55、60和65 h，沿氣室將氣室鈍端蛋殼揭去，掀去內(nèi)殼膜，暴露出雞胚。然后用注射器將臺盼藍注射到胚盤下方，體視顯微鏡下觀察雞胚的體節(jié)，每個時間組觀察3枚雞胚。

1. 5 PGC移植

雞胚分成4組，分別孵育50、55、60和65 h后進行移植注射。具體操作步驟：收集GFP-PGC離心，重懸，細胞計數(shù)，取所需細胞數(shù)，加培養(yǎng)液至總體積的90%，然后加入10%臺盼藍，混勻。將孵育到預(yù)定時間的雞胚取出，酒精噴灑表面并擦干，照蛋確定氣室，在氣室中間用彎頭鑷子開一個直徑約0.5 cm的小孔，用尖鑷撕開蛋殼膜，暴露出雞胚。用微量注射針吸取細胞，注入雞胚血脈系統(tǒng)中，每枚雞胚注入1萬個細胞。用封口膜封閉，將雞胚放回孵育箱中繼續(xù)孵育。

1. 6 解剖雞胚分離性腺

移植注射5 d后取出活胚，用鑷子分離雞胚性腺，置于滴有80 μL PBS的載玻片上，蓋上蓋玻片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計GFP陽性細胞數(shù)或判定性腺中遷移細胞的等級。由于性腺中的GFP陽性細胞數(shù)超過500個時，細胞重疊造成計數(shù)困難，因此將性腺按照如下規(guī)則劃分為6個等級。Ⅵ級：兩條性腺布滿GFP陽性細胞；Ⅴ級：一條性腺全滿，另一條性腺半滿或兩條都是一大半；Ⅳ級：一條性腺全滿，另一條性腺很少或兩條性腺都是半滿；Ⅲ級：一條性腺半滿，另一條性腺很少或兩條性腺加起來超過500個GFP陽性細胞；Ⅱ級：GFP陽性細胞數(shù)在200～500個；Ⅰ級：GFP陽性細胞數(shù)少于200個。

1. 7 數(shù)據(jù)處理

以ImageJ 1.45統(tǒng)計細胞數(shù)，采用GraphPad Prism v5.0對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PGC培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染GFP基因

在經(jīng)γ射線處理的MEF飼養(yǎng)層上，PGC生長狀況良好，細胞呈圓形、邊緣光亮、體積較大、細胞核大等形態(tài)特征。PGC增殖較快，通常能看到兩個連在一起或成串的細胞。用Lipofectamine■ LTX & PLUSTM Reagent轉(zhuǎn)染PiggyBac轉(zhuǎn)座子，結(jié)果獲得表達綠色熒光蛋白的PGC（稱為GFP-PGC）（圖1），共轉(zhuǎn)染兩孔，轉(zhuǎn)染效率分別為5.03%和6.16%。經(jīng)過3代篩選后，獲得表達GFP的細胞株。

2. 2 雞胚胚齡的確定

于雞胚孵育到相應(yīng)的時間后打開雞胚，在雞胚胚盤下注射臺盼藍，通過觀察雞胚的體節(jié)（圖2）而確定廣西黃羽雞胚孵育時間所對應(yīng)的胚齡。結(jié)果表明，孵育50、55、60、65 h的雞胚分別出現(xiàn)21～22對、24～25對、27～28對和30～32對體節(jié)，對應(yīng)的胚齡為14HH、15HH、16HH和17HH。

2. 3 移植胚齡對雞胚存活率的影響

分別在孵育至14HH、15HH、16HH和17HH時移植PGC，移植5 d后將雞蛋打開，觀察雞胚的死亡情況。結(jié)果如圖3所示，雞胚死亡率為30.0%～60.9%，方差分析結(jié)果顯示4個移植胚齡間的雞胚死亡率差異不顯著（P>0.05）。

2. 4 PGC的遷移效率

熒光顯微鏡下觀察不同受體胚齡移植GFP-PGC的遷移效率，每組檢測20枚雞胚，共檢測80枚。結(jié)果表明，根據(jù)雞胚性腺中GFP陽性細胞數(shù)可劃分為6個等級（I～VI），且隨著孵育時間的增加，PGC遷移效率呈下降趨勢（圖4）。14HH移植組雞胚性腺中的GFP陽性細胞集中在V級（40.0%），15HH移植組的集中在III級（42.1%），16HH和17HH移植組則集中在II級（45.4%和54.5%），GFP陽性細胞含量最高等級（VI級）僅出現(xiàn)在14HH移植組（圖5），說明雞胚孵育至14HH時回注PGC的遷移效率最高。

3 討論

轉(zhuǎn)基因家禽作為發(fā)育生物學(xué)研究的一個理想生物體模型（Rashidi and Sottile，2009），可用于培育抗病或高生產(chǎn)性能的優(yōu)良品種家禽及藥用蛋白的生物反應(yīng)器（Lillico et al.，2005），具有廣泛的應(yīng)用前景。McGrew等（2004）將重組慢病毒注射到新鮮產(chǎn)下的受精蛋胚盤中，獲得轉(zhuǎn)基因嵌合體后代。Macdonald等（2012）利用PiggyBac及Tol2轉(zhuǎn)座子有效轉(zhuǎn)染PGC后回注到雞胚血脈系統(tǒng)，獲得表達GFP蛋白的轉(zhuǎn)基因雞。Tyack等（2013）用miniTol2轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒直接體內(nèi)轉(zhuǎn)染PGC獲得穩(wěn)定的生殖系轉(zhuǎn)基因公雞，且能將轉(zhuǎn)基因傳遞給下一代。但這些研究獲得轉(zhuǎn)基因雞的效率均相對較低，因此有必要進一步提高外源PGC遷移到性腺的效率而提高轉(zhuǎn)基因嵌合效率。本研究通過系統(tǒng)探究移植時間對PGC遷移效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞胚孵育至50 h（14HH）時移植PGC的遷移效率較孵育至更后期再移植的高，與Nakamura等（2007）研究表明雞PGC于14HH時在血液中達到峰值相符。

根據(jù)PGC在雞胚發(fā)育不同時期的遷移和分布情況，有關(guān)學(xué)者已成功從血液、性腺中分離獲得雞PGC （Shiue et al.，2009；Tonus et al.，2014）；但由于PGC在體外易分化，為保持其未分化狀態(tài)及生物學(xué)特性，通常需要在培養(yǎng)液中添加FGF、LIF、SCF等各種生長因子。本研究以孵育14HH～15HH雞胚血液為分離材料，用MEF飼養(yǎng)層及KO-DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，成功分離獲得雄性PGC細胞系，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因研究提供了充足的細胞來源。本研究選用的雞胚孵育50 h為21～22對體節(jié)、55 h為24～25對體節(jié)、60 h為27～28對體節(jié)、65 h為30～32對體節(jié)，分別對應(yīng)14HH、15HH、16HH和17HH，與Hamburger和Hamiltion（1992）、李碧春等（2000）研究觀察到的雞胚發(fā)育時期一致。此外，本研究分別統(tǒng)計14HH～17HH雞胚移植PGC后的死亡率，結(jié)果表明，移植5 d后雞胚的死亡率為30.0%～60.9%，越早期進行注射移植，雞胚死亡率越高，但差異不顯著。雞胚在整個孵育階段有兩個死亡高峰，一個是在孵育3～5 d，另一個是在18 d以后（薛松磊等，2013）。本研究在雞胚齡14HH～17HH（孵育50～65 h）時進行顯微注射，可能也是造成雞胚死亡增加的一個重要原因。但由于更早期的雞胚血液系統(tǒng)尚未完全發(fā)育，注射操作十分困難，因此PGC移植注射的最佳時間窗口為14HH雞胚。

4 結(jié)論

隨著受體胚齡的增加，PGC遷移效率呈下降趨勢，但鑒于實際操作的難易程度，確定PGC移植注射的最佳時間窗口為14HH雞胚（孵育50 h）。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）