樊海平　林煜　鐘全?！∏刂厩?/p>

摘要：【目的】明確浸浴硝唑尼特（NTZ）對刺激隱核蟲的驅(qū)蟲效果，為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā繉TZ溶于二甲亞砜（DMSO）制成溶液，探討NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲和滋養(yǎng)體的驅(qū)蟲效果，并分析藥物濃度、日換水量、硫酸銅（CuSO4）和滲透劑對其驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的影響?！窘Y(jié)果】NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲的殺滅作用隨藥物濃度的升高而逐漸提高，至20.0 μg/L時刺激隱核蟲感染幼蟲的死亡率達97.33%。經(jīng)1.0 g/m3 NTZ浸浴72 h后，患病大黃魚的刺激隱核蟲滋養(yǎng)體完全脫落；NTZ與CuSO4配伍能有效提高藥物對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3浸浴72 h后患病大黃魚體表和鰓部均無刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生，病魚存活率達100.00%；滲透劑氮酮和換水方式與NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果無相關(guān)性?！窘Y(jié)論】NTZ浸浴魚體能有效驅(qū)殺刺激隱核蟲滋養(yǎng)體，尤其與CuSO4配伍可有效提高藥物對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果，生產(chǎn)中建議使用劑量為NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3。

關(guān)鍵詞： 刺激隱核蟲；硝唑尼特；大黃魚；浸浴；驅(qū)蟲效果

中圖分類號： S941.51 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0489-05

0 引言

【研究意義】刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans Brown）又稱海水小瓜蟲（Ichthyophthirius marinus），隸屬于原生動物門、纖毛亞門、寡膜纖毛綱、膜口亞綱、膜口目、凹口科、隱核蟲屬（許丹和劉興旺，2014）。除黃斑藍子魚（Siganus oramin）等少數(shù)魚類外，刺激隱核蟲能感染大部分海水硬骨魚類，且易導(dǎo)致大量死亡，對海水養(yǎng)殖業(yè)的危害極其嚴重（Wang et al.，2010）。在我國大黃魚（Pseudosciaena crocea）養(yǎng)殖生產(chǎn)中，刺激隱核蟲的發(fā)病死亡率高達60%～100%（王國良等，2013），流行季節(jié)病死率在80%以上，每年造成的經(jīng)濟損失在2億元以上（蘇躍中，2009）。因此，尋找可有效防治刺激隱核蟲病的新型藥物對保障海水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中預(yù)防刺激隱核蟲病的常見措施有強化營養(yǎng)提高魚體免疫力、降低養(yǎng)殖密度、定期消毒等（陸建學(xué)等，2007）。此外，也有采用硫酸銅、奎寧、亞甲藍、苯扎氯銨、苯氧乙醇、福爾馬林（Pironet and Jones，2000；Hirazawa et al.，2003）及四環(huán)素（Reichenbach-Klinke，1978）、中草藥（陳章群，2005）、乙酸（鄔陽等，2013）等進行浸浴治療。Reichenbach-Klinke（1978）提出，將病魚放在13 mg/L四環(huán)素溶液中浸浴30 s可殺死部分刺激隱核蟲；陳章群（2005）用檳榔、苦參和苦楝等中草藥配伍，熬制湯藥后全池潑灑，4 d后患有刺激隱核蟲病的紅鰭東方鲀體表白點消失，治愈率達90%；鄔陽等（2013）研究表明，使用157.4 mg/L乙酸累計處理2 h可有效殺滅全部刺激隱核蟲幼蟲；馬寧等（2015）研究了18種中草藥浸出液在體外對刺激隱核蟲幼蟲和包囊的殺滅效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以辣椒和檳榔的殺蟲效果最佳，而牽牛子、貫眾、黃柏、茯苓、荊芥、熟地黃、鶴虱沒有殺蟲效果?！颈狙芯壳腥朦c】硝唑尼特（Nitazoxanide，NTZ）是一種新型廣譜、高效抗寄生蟲和微生物藥物，對多種原蟲、吸蟲、線蟲、蠕蟲感染和敏感腸道菌感染有特效，且安全性高、應(yīng)用范圍廣（董靖等，2010）。但目前僅見NTZ對斑馬魚的急性毒性試驗報道（張德利等，2011），對其他水產(chǎn)動物的毒性及對魚類寄生蟲的驅(qū)殺效果鮮見研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲和滋養(yǎng)體的驅(qū)蟲效果，并分析藥物濃度、日換水量、硫酸銅（CuSO4）和滲透劑對其驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的影響，以期為NTZ在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

NTZ（生產(chǎn)批號20150217XZ，純度在98%以上）購自湖北巨勝科技有限公司，試驗時按1∶5（g/mL）比例溶于二甲基亞砜（DMSO，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；氮酮（純度在98%以上）購自南京峰云化工有限公司；CuSO4（分析純）購自天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；鹽酸土霉素（純度在98%以上）購自陜西正大生物科技有限公司。大黃魚由福建福鼎海鷗水產(chǎn)食品有限公司網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地提供，其規(guī)格為50～130 g/尾，抽樣檢查發(fā)現(xiàn)魚體表和鰓部寄生有大量刺激隱核蟲；經(jīng)活水船運回實驗室后，暫養(yǎng)于直徑為1.0 m的玻璃鋼桶中，連續(xù)充氣增氧，每天換水1次（砂濾），每次換水30%左右；暫養(yǎng)2～3 d后檢查，蟲體數(shù)量不斷增加，即可用于后續(xù)試驗。

1. 2 刺激隱核蟲感染幼蟲培養(yǎng)

收集從大黃魚體表和鰓部脫落的刺激隱核蟲包囊，于25 ℃下孵化40 h后可獲得感染幼蟲，海水調(diào)整幼蟲濃度至1000個/mL。

1. 3 NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲的殺滅試驗

將DMSO溶解的NTZ用海水分別稀釋至2.0、4.0、10.0、20.0和40.0 μg/L，各取50.0 μL加至96孔細胞板中，然后加入刺激隱核蟲感染幼蟲液50.0 μL，NTZ終濃度為1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μg/L，每個濃度梯度設(shè)3個重復(fù)。培養(yǎng)板放入25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，倒置顯微鏡下觀察刺激隱核蟲感染幼蟲的死亡情況。

1. 4 NTZ對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)蟲試驗

設(shè)NTZ 0.5 g/m3、NTZ 1.0 g/m3、NTZ 0.5 g/m3+ CuSO4 0.5 g/m3及無藥對照組（CK），每組6尾病魚，3個重復(fù)。試驗期間連續(xù)充氣增氧，水溫控制在26～27 ℃，每隔24 h換水補藥（1/2）一次。共浸浴72 h，每日記錄魚體死亡情況，并分別于浸浴48和72 h取全鰓鏡檢刺激隱核蟲滋養(yǎng)體數(shù)量。

1. 5 NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的正交試驗

選取NTZ濃度（0、1.0和1.6 g/m3）、日換水量（0、40%和70%）、CuSO4（0、0.3和0.6 g/m3）和滲透劑氮酮（0、0.3和0.6 g/m3）4個因素進行正交試驗（表1），每組20尾大黃魚苗（規(guī)格6～8 cm）。試驗在盛有50 L海水的150 L塑料桶內(nèi)進行，試驗期間連續(xù)充氣增氧，水溫控制在26～27 ℃，每隔24 h換水補藥（1/2）一次。共浸浴72 h，分別于浸浴24、48和72 h取病魚的鰓、鰭和30%左右體表黏液進行鏡檢，每組每次取病魚3尾。

1. 6 NTZ與CuSO4配伍對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)蟲試驗

設(shè)NTZ 2.0 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3、NTZ 1.5 g/m3+ CuSO4 0.5 g/m3及無藥對照組（CK），每組15尾病魚。試驗期間連續(xù)充氣增氧，水溫控制在26～27 ℃，每隔24 h換水補藥（1/2）一次。共浸浴72 h，分別于浸浴48和72 h取病魚全鰓和30%左右黏液檢查刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生情況。同時，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3對刺激隱核蟲感染率達100%且出現(xiàn)輕度爛鰓和鱗片脫落的大黃魚苗（規(guī)格6～8 cm）進行驅(qū)蟲治療。

2 結(jié)果與分析

2. 1 NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲的殺滅效果

由表2可以看出，在4 h內(nèi)1.0 μg/L NTZ對刺激隱核蟲感染幼蟲無殺滅作用，但隨藥物濃度的升高，其殺滅能力逐漸提高，至20.0 μg/L時刺激隱核蟲感染幼蟲的死亡率達97.33%。

2. 3 NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的正交試驗結(jié)果

由表4可以看出，NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果與藥物濃度呈正相關(guān)，即藥物濃度越高，其驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果越佳；NTZ與CuSO4配伍可明顯提高其對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果，呈疊加效應(yīng)；滲透劑氮酮和日換水量與NTZ驅(qū)除刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的效果無相關(guān)性。

2. 4 NTZ與CuSO4配伍對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果

由表5可以看出，NTZ 2.0 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3和NTZ 1.5 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3處理組病魚經(jīng)浸浴24、48和72 h的死亡率分別為6.67%、20.00%、26.67%和6.67%、19.67%、26.33%；而CK組病魚在浸浴24、48和72 h的死亡率分別為13.33%、73.33%和100.00%。浸浴48和72 h后檢查試驗組大黃魚的體表和鰓，未發(fā)現(xiàn)有刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生；而CK組48 h時檢查大黃魚的體表和鰓，發(fā)現(xiàn)仍有大量刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生。以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3對刺激隱核蟲感染率達100%且出現(xiàn)輕度爛鰓和鱗片脫落的大黃魚苗進行驅(qū)蟲治療，病魚存活率達100.00%，浸浴48 h檢查發(fā)現(xiàn)病魚的鰓和體表有少量刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生，浸浴72 h后大黃魚體表和鰓部已無刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生。

3 討論

NTZ為口服藥物，是第一個被美國食品和藥品管理局（FDA）批準為專門用于治療隱孢子蟲感染的藥物（劉耀文，2003），其優(yōu)點是既可驅(qū)治多種蠕蟲，又可驅(qū)治原蟲（主要是腸道及腔道寄生原蟲）（沈一平等，2006），但至今其藥效作用機制尚未明確。根據(jù)藥物活性譜研究結(jié)果可知，NTZ首先對厭氧或微需氧蟲種有效，其結(jié)構(gòu)特征與氯氰碘柳胺及其相關(guān)化合物相似，與阿苯達唑、甲苯達唑和甲硝唑相比，NTZ的抗寄生蟲譜與抗菌譜更廣（張可煜等，2007）。在國外，NTZ主要用于治療犬、貓的蠕蟲感染（趙占中，2009）；而國內(nèi)的研究表明，NTZ對犬、羊、雞、兔、鼠等動物體內(nèi)的寄生蟲均有治療作用（趙占中，2009；Zhang et al.，2010）。本研究通過對大黃魚刺激隱核蟲進行藥物浸浴驅(qū)殺試驗，結(jié)果證實NTZ浸浴魚體能有效驅(qū)殺刺激隱核蟲滋養(yǎng)體，也佐證了該藥在水產(chǎn)寄生蟲病防治中應(yīng)用的可能性。

CuSO4對刺激隱核蟲的有效性已得到證實（潘孝益等，1994；毛國民等，2005；陸建學(xué)等，2007）。本研究通過TNZ與CuSO4配伍，既充分發(fā)揮TNZ對寄生蟲幼蟲和滋養(yǎng)體的殺滅作用及對包囊的抑制作用，又兼顧CuSO4對刺激隱核蟲成蟲和幼蟲的殺滅作用，結(jié)果顯示，以NTZ 1.2 g/m3+CuSO4 0.5 g/m3對感染刺激隱核蟲且出現(xiàn)輕度爛鰓和鱗片脫落的大黃魚苗進行浸浴治療，病魚存活率達100.00%，浸浴72 h后大黃魚體表和鰓部已無刺激隱核蟲滋養(yǎng)體寄生。可見，TNZ與CuSO4配伍可有效提高藥物對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果。

本研究結(jié)果表明，通過浸浴驅(qū)殺刺激隱核蟲，除部分蟲體被殺滅外，大部分滋養(yǎng)體在藥物作用下迅速形成包囊并脫離魚體。這些脫落的刺激隱核蟲包囊經(jīng)過一段時間的發(fā)育，又能孵化出感染幼蟲重復(fù)感染魚體，且感染幼蟲數(shù)量較原滋養(yǎng)體數(shù)量呈幾百倍增長，重復(fù)感染對魚體危害更嚴重。因此，實際生產(chǎn)中要有效控制刺激隱核蟲重復(fù)感染，可用水流將脫落的刺激隱核蟲包囊沖出養(yǎng)殖區(qū)，并集中進行殺滅處理，且必須在包囊孵出感染幼蟲前進行殺滅處理等。

4 結(jié)論

NTZ浸浴魚體能有效驅(qū)殺刺激隱核蟲滋養(yǎng)體，尤其與CuSO4配伍可有效提高藥物對刺激隱核蟲滋養(yǎng)體的驅(qū)除效果，生產(chǎn)中建議使用劑量為NTZ 1.2 g/m3+

CuSO4 0.5 g/m3。

參考文獻：

陳章群. 2005. 利用中草藥防治紅鰭東方鲀刺激隱核蟲病[J]. 中國水產(chǎn)，（5）：51-52.

Chen Z Q. 2005. Utilization of Chinese herbal medicine to control Takifugu rubripes infected by Cryptocaryon irritans[J]. Chinese Aquatic Products，（5）：51-52.

董靖，鄧旭明，鄧彥宏. 2010. 抗寄生蟲新藥硝唑尼特研究進展[J]. 中國獸藥雜志，44（5）：51-53.

Dong J，Deng X M，Deng Y H. 2010. Progress of a new antiparasite drug nitazoxanide[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug，44（5）：51-53.

劉耀文. 2003. 2002年美國FDA批準的新藥及生物制品[J]. 國外醫(yī)藥（藥學(xué)分冊），30（3）：192-193.

Liu Y W. 2003. New drug and biological products approved by U.S. FDA in 2002[J]. Foreign Medical Sciences Section on Pharmacy，30（3）：192-193.

陸建學(xué)，辛儉，周凱，樓寶，夏連軍，毛國民. 2007. 黃鯛刺激隱核蟲的防治研究[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化，（2）：32-34.

Lu J X，Xin J，Zhou K，Lou B，Xia L J，Mao G M. 2007. Research on prevention and treatment of Cryptocaryon irritans on Taius tumifrons[J]. Fishery Modernization，（2）：32-34.

馬寧，黎銘，李旻，曾地剛. 2015. 中草藥浸出液體外殺滅刺激隱核蟲的效果[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，27（11）：95-98.

Ma N，Li M，Li M，Zeng D G. 2015. Killing effect of chinese herbal leachate on Cryptocaryon irritans in vitro[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（11）：95-98.

毛國民，辛儉，於海濱，史海東. 2005. 黑鯛Sparus macrocephalus （Basilewsky）刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）的防治研究[J]. 現(xiàn)代漁業(yè)信息，20（9）：24-25.

Mao G M，Xin J，Yu H B，Shi H D. 2005. A study on prevention and treatment of Cryptocaryon irritans on Sparus marcrocephalus（Basilewsky）[J]. Modern Fisheries Information，20（9）：24-25.

潘孝益，施衛(wèi)旭，鄺國輝. 1994. 海水養(yǎng)殖魚類暴發(fā)刺激隱核蟲病的診治報告[J]. 中國動物檢疫，11（6）：16-17.

Pan X Y，Shi W X，Kuang G H. 1994. Diagnosis and treatment report on outbreaks of marine fishes infected by Cryptocaryon irritans[J]. China Animal Quarantine，11（6）：16-17.

沈一平，管曉虹，馮振卿. 2006. 廣譜抗腸道寄生蟲藥硝唑尼特（nitazoxanide）研究進展[J]. 國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志，33（4）：221-224.

Shen Y P，Guan X H，F(xiàn)eng Z Q. 2006. The progress in investigation of a broad-spectrum intestinal antiparasitic drug-nitazoxanide[J]. International Journal of Medical Parasitic Di-

seases，33（4）：221-224.

蘇躍中. 2009. 福建省主要養(yǎng)殖區(qū)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類刺激隱核蟲病的調(diào)查及防控對策[J]. 水產(chǎn)科技情報，36（1）：4-7.

Su Y Z. 2009. Investigation of fishes cultured marine cage infected by Cryptocaryon irritans in main mariculture areas and its prevention and control in Fujian[J]. Aquatic Science and Technology Information，36（1）：4-7.

王國良，周曼曦，徐益軍. 2013. 刺激隱核蟲LAMP檢測方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，35（7）：574-577.

Wang G L，Zhou M X，Xu Y J. 2013. Establishment of the loop-mediated isothermal amplification for the detection of Cryptocaryon irritans[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，35（7）：574-577.

鄔陽，牛素芳，金媛，毛勇，蘇永全. 2013. 閩東海域刺激隱核蟲的生活史觀察及乙酸殺蟲效果[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），52（2）：281-288.

Wu Y，Niu S F，Jin Y，Mao Y，Su Y Q. 2013. Observation on the life history of Cryptocaryon irritans in Eastern Sea of Fujian and research on antiparasitic effect of acetic acid[J]. Journal of Xiamen University（Natural Science），52（2）：281-288.

許丹，劉興旺. 2014. 刺激隱核蟲病害情況分析與防控措施探討[J]. 海洋與漁業(yè)，（1）：68-69.

Xu D，Liu X W. Situation，prevention and control measures of Cryptocaryon irritans[J]. Marine and Fishery，（1）：68-69.

張德利，吳永魁，張西臣. 2011. 硝唑尼特對斑馬魚和赤子愛勝蚓的急性毒性試驗[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，32（7）：121-124.

Zhang D L，Wu Y K，Zhang X C. 2011. Acute toxicity test of nitazoxanide on Brachydanio rerio and Eisenia foetida[J]. Pro-

gress in Veterinary Medicine，32（7）：121-124.

張可煜，王國永，薛飛群. 2007. 抗寄生蟲新藥硝唑尼特研究進展[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊，（12）：30-32.

Zhang K Y，Wang G Y，Xue F Q. 2007. Research progress of new anti-parasitic drug nitazoxanide[J]. Veterinary Orientation，（12）：30-32.

趙占中. 2009. 硝唑尼特在山羊體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)及毒理學(xué)研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.

Zhao Z Z. 2009. Study on pharmacokinetics and toxicology of nitazoxanide in goats[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.

Hirazawa N，Goto T，Shirasu K. 2003. Killing effect of various treatments on the monogenean Heterobothrium okamotoi eggs and oncomiraddia and the ciliate Cryptocaryon irritans cysts and theronts[J]. Aquaculture，223（1-4）：1-13.

Pironet F N，Jones J B. 2000. Treatments for ectoparasites and diseases in captive Wetem Australian dhufish[J]. Aquaculture International，8（4）：349-361.

Reichenbach-Klinke H H. 1978. Fish Pathology[M]. London： Bailliere Tindall.

Wang F H，Xie M Q，Li A X. 2010. A novel protein isolated from the serum of rabbitfish（Siganus oramin） is lethal to Cryptocaryon irritans[J]. Fish & Shellfish Immunology，29（1）：32-41.

Zhang R Y，Shang L M，Jin H T，Ma C P，Wu Y K，Liu Q，Xia Z P，Wei F，Zhu X Q，Gao H. 2010. In vitro and in vivo antileishmanial efficacy of nitazoxanide against Leishmania donovani[J]. Parasitology Research，107（2）：475-479.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）