劉海霞 莫海江 程玉紅 馬洪波 夏海東 洪偉 董紅星 陳軍營

摘要：本研究首次在小麥幼胚脫分化過程中利用Affymetrix小麥基因芯片技術(shù)對MADS—box基因表達變化進行檢測，共檢測到20個MADS-box基因，其中14個基因下調(diào)表達，6個基因混合表達。這些基因大量下調(diào)表達，推測其在小麥幼胚脫分化中具有較強的抑制作用。此外發(fā)現(xiàn)，12 h是小麥幼胚脫分化過程中MADS-box基因表達的一個關(guān)鍵時期。選取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992四個基因進行半定量RT-PCR驗證，檢測結(jié)果與小麥基因芯片結(jié)果基本一致。

關(guān)鍵詞：小麥；MADS-box基因；基因芯片；幼胚；脫分化

中圖分類號：S512.101：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942（2016）03—0009—05

MADS-box基因是由酵母中的MCM1、擬南芥中的AG、金魚草中的DEFICIENS和人類中的SRF4種MADS-box基因的首字母縮寫而成。MADS-box基因家族是一類序列特異的多基因家族，其所編碼的MADS-box蛋白即為MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，它以多聚體的形式通過其保守結(jié)構(gòu)域與特定的DNA序列結(jié)合來調(diào)控基因表達，其主要功能表現(xiàn)為激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在許多植物基因組中存在數(shù)量不等的MADS-box重復(fù)基因，研究較早較多的植物是擬南芥、金魚草和矮牽牛，之后在水稻、油菜、罌粟、豌豆、番茄、葡萄、玉米、小麥等多種植物中也發(fā)現(xiàn)了MADS-box基因的存在。MADS-box基因具有多種生物學(xué)功能，它不僅與植物花器官的發(fā)育、花時的調(diào)控以及其它生殖生長過程有關(guān)，而且也在根的形成、葉的生長和植物抗逆反應(yīng)中起作用，其中，在擬南芥根部表達的MADS—box基因至少有50個。隨著研究的深入，人們對MADS—box基因的研究逐漸拓展到小麥上來。研究發(fā)現(xiàn)，TaVRT-1基因在春化誘導(dǎo)的植物中表達，該基因Vrn-1區(qū)域與春化處理和耐冬性有關(guān)。TaMADS#11是TaVRT-1的一個同源基因，同樣具有促進營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的功能。WP11和WP12是小麥中分離出來的兩個與心皮化有關(guān)的基因，表達部位集中在小花漿片原基和雄蕊原基，該基因?qū)儆贐組PI亞家族基因。TaMADS#82是一個與WP11表達模式相似的基因。此外發(fā)現(xiàn)，WAG基因與小麥幼穗發(fā)育有關(guān)，VRNl和VRN2基因與小麥開花結(jié)實相關(guān)。MADS-box基因的研究雖然有增多趨勢，但在小麥中的研究仍處于起步階段，對小麥幼胚脫分化過程的研究至今尚未見報道。

本試驗用豫麥18幼胚為材料，在2，4-D誘導(dǎo)條件下進行脫分化處理，結(jié)合基因芯片技術(shù)，檢測不同時間點MADS-box基因的差異表達情況，對揭示它們在小麥幼胚脫分化過程中的作用具有重要的參考意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

利用豫麥18作為試材，于小麥授粉后16 d采集幼穗在無菌條件下剝?nèi)∮着?，放置于MS+2，4-D（2 mg/L）培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，分別于脫分化處理0、2、6、12、24、72 h時取樣，用液氮處理，-70%低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1小麥幼胚總RNA的提取 總RNA的提取按QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit試劑盒操作程序進行?？俁NA純化按QIAGEN公司的RNeasy mini試劑盒操作程序進行。用DEPC處理過的ddH20溶解RNA，瓊脂糖凝膠電泳（180V，0.5 h）對總RNA 28S和18S比例進行檢測，在260/280 nm波長下測定總RNA的吸光值，計算其濃度和純度。

1.2.2小麥幼胚cDNA、cRNA的合成與純化按照Affymetrix公司方法進行cDNA、cRNA合成。eDNA合成需取1～8μg總RNA作為模板。生物素標記的eRNA合成需取12μL上述eDNA溶液作為模板。按基因芯片分析樣品純化操作程序?qū)DNA、cRNA進行純化。按1.2.1方法對cDNA、eRNA濃度、純度和質(zhì)量進行檢測。1.2.3

小麥幼胚cRNA片段化和芯片檢測

在1.5 mL無RNA酶、滅菌的離心管中加入濃度為1μg/μL的cRNA 15 μL，5×片段化緩沖液6 μL，無RNA酶水9μL，將體系混勻，94℃溫浴35min，冰上放置，獲得長度為35～200 bp的cRNA片段。雜交液的配制按Affymetrix公司提供的配方進行，再將其加入到經(jīng)過預(yù)雜交處理的Affy—metrix Wheat Gene Chip中，45℃、60 r/min雜交16 h。采用全自動洗滌工作站450（Affymetrix公司，USA）對基因芯片進行洗滌和染色，采用高分辨芯片掃描儀3000（Affymetrix公司，USA）對基因芯片進行掃描，獲得各基因不同時間點的表達信號值。

1.2.4小麥幼胚基因芯片檢測參數(shù)的獲取信號值的讀取、處理采用GCOSl.2軟件，并對獲取的信號值、信號檢出（P，A，M）以及試驗與對照組問的比值進行歸一化處理。

1.2.5小麥幼胚基因芯片MADS—box家族基因的確認

通過NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）、DATF（datf.cbi.pku.edu.cn）和DRTF（drtf.cbi.pku.edu.cn）等網(wǎng)站在擬南芥和水稻等植物數(shù)據(jù)庫中查找MADS—box家族相關(guān)基因的名稱，根據(jù)基因名稱在小麥基因芯片上查找相應(yīng)名稱，獲取各時間點的熒光信號值。計算不同時間點熒光信號值與0 h（對照）熒光信號值的比值，并算出各比值以2為底的對數(shù)，當對數(shù)值小于-1為有意義下調(diào)差異表達，當對數(shù)值大于+1為有意義上調(diào)差異表達。

1.2.6 MADS-box基因半定量RT-PCR驗證

利用反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，用β-actin作為內(nèi)參，從MADS-box家族基因中抽取CA670406等4個基因進行半定量RT-PCR驗證。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1.0 μL，10×Buffer5.0 iμL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，25 mmol/LMgCl₂3.0 μL，20 μmol/L上下游引物各1.25 μL，5 U/μL Taq酶0.2μL，ddH₂O加至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。取5μL反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。引物序列及擴增產(chǎn)物長度見表1。

2結(jié)果與分析

2.1 MADS-box基因家族中PI亞族基因的表達分析

編碼花器官相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PI（HSTILLATA protein）的基因?qū)儆诨òl(fā)育ABC模型中的B類基因，在花瓣、雄蕊的形成中發(fā)揮作用。在小麥幼胚脫分化過程中，檢測到的PI轉(zhuǎn)錄因子基因在12～24 h下調(diào)表達，其靶基因WP11（AB107991）和WPI2（AB107992）分別在12、72 h和6～24 h下調(diào)表達（圖1）。推測在小麥幼胚脫分化過程中，PI轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因具有一定的抑制作用。

2.2 MADS—box基因家族中AG亞族基因的表達分析

參與決定雄蕊、心皮、花分生組織形成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AG（Floral homeotic protein）基因的研究較早出現(xiàn)在擬南芥和金魚草中，之后發(fā)現(xiàn)該類基因在小麥成熟胚脫分化過程中表達。在小麥幼胚脫分化過程中，也發(fā)現(xiàn)一個編碼AG的基因CA658343，其在12、72 h下調(diào)表達。具有獨立促進心皮分化功能的靶基因SPT（SPATULA）有4個成員（CK213813、BE417035、CA608865、BJ272559），BJ272559僅在12 h有意義下調(diào)表達；BE417035在12 h下調(diào)，24～72 h轉(zhuǎn)為上調(diào)；CK213813、CA608865在2～6 h上調(diào)，12 h轉(zhuǎn)為下調(diào)，24～72h上調(diào)（圖1）。

2.3 MADS-box基因家族中AGL9亞族基因的表達分析

在小麥幼胚脫分化過程中，發(fā)現(xiàn)編碼調(diào)節(jié)外界信號反應(yīng)蛋白AGL9的5個基因（BJ221584、BJ276784、CA726603、CD374109、CN009238，圖1）。這5個基因在幼胚脫分化過程中均呈下調(diào)表達趨勢，其中在2、12 h全部下調(diào)。靶基因AG有一個成員（CA658343），僅在12、72 h表達。靶基因fbp2編碼果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase），有兩個成員（CD894372、CA686703），其中，CD894372在2～6、24～72 h上調(diào)表達，在12 h下調(diào)表達，CA686703僅在6～12h下調(diào)表達。

2.4 MADS—box基因家族中CO亞族基因的表達分析

CO亞族基因編碼開花時間早晚的成花計時相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄的mRNA達到一定域值時可顯著地促進靶基因LFY的表達。本試驗編碼轉(zhuǎn)錄因子CO的有4個基因（BE442521、BG906984、CA670406、CA730918），在小麥幼胚脫分化過程中呈下調(diào)趨勢，12 h時下調(diào)幅度最大，推測這4個基因在12 h抑制作用最強。其中，BG906984在2～72 h均下調(diào)。靶基因LFY（CD911368）在12 h下調(diào)（圖1）。推測在小麥幼胚脫分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子CO基因?qū)ζ浒谢騆FY（CD911368）可能具有一定的促進作用。

2.5 RT-PCR檢測MADS-box基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性

根據(jù)小麥基因芯片信號值的高低，抽取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992共4個MADS-box基因進行RT-PCR檢測（以β-actin內(nèi)參作為對照），對基因芯片數(shù)據(jù)可靠性進行驗證。經(jīng)比較可知，小麥基因芯片結(jié)果與RT—PCR檢測結(jié)果基本一致，說明Affymetrix小麥基因芯片數(shù)據(jù)相對可靠。

3結(jié)論與討論

MADS-box基因的生物學(xué)功能非常豐富，但前人研究內(nèi)容主要側(cè)重于植物生殖生長如花器官發(fā)育、種子發(fā)育、果實發(fā)育等方面，研究對象主要集中于擬南芥、水稻等植物。本試驗在對小麥成熟胚脫分化中MADS-box基因的表達進行分析的基礎(chǔ)上，對小麥幼胚脫分化中MADS-box基因的表達變化進行研究，證明MADS-box基因不僅在小麥成熟胚脫分化中表達，而且也在小麥幼胚脫分化中表達，拓寬了MADS-box家族基因在小麥中的表達范圍。此外，本研究再次證明MADS-box基因在生理學(xué)上具有分化、脫分化雙重功能。本試驗共研究了20個MADS-box基因的表達變化，這些基因整體以下調(diào)表達為主，其中下調(diào)表達基因共14個，混合表達基因6個，表明小麥幼胚脫分化過程是一個受多個MADS-box基因控制的復(fù)雜的調(diào)控過程。這些基因大量下調(diào)表達，推測它們在幼胚脫分化中抑制作用相對較強。在小麥幼胚脫分化的各個時期，20個MADS-box基因在12 h均下調(diào)，其中19個基因的下調(diào)值是對照值的15倍，表明12 h是MADS-box基因大量表達的一個關(guān)鍵時期。此外，MADS-box基因在幼胚脫分化中發(fā)生上調(diào)的有6個，表達強度變化較小，上調(diào)值達到對照3.7倍的僅有CD894372、BE417035、CK213813這3個基因，推測這些基因在小麥幼胚脫分化過程中具有一定的促進作用。