宋佳　王玨　劉蕾　王輝

摘要：以擬南芥中控制硫苷生物合成相關基因家族GS-Elong的全長CDS及蛋白序列為參考序列，在甘藍（Brassica oleracea L.）基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLASTN和BLASTP檢索，得到具備Score≥100、E-value≤10^-10。和Coverage I>70%條件的甘藍注釋基因作為擬南芥GS-Elong位點基因的候選同源基因，并進一步對其進行同源性和基因結構比較及聚類分析。結果顯示，在甘藍GS-Elong位點發(fā)現(xiàn)4個旁系同源基因（Bo1020647、Bo1017070、B01037823和B01017071）。甘藍和擬南芥GS-Elong位點同源基因在核酸水平上的一致性為66.1%～84.3%；甘藍4個旁系同源基因問的一致性在62.0%～83.7%之間。甘藍和擬南芥GS-Elong位點基因在外顯子數(shù)目、大小方面高度一致，但B01017071和B01037823分別較擬南芥GS-Elong位點基因少3個和1個外顯子。系統(tǒng)進化及共線性分析初步確定，甘藍中存在2個BoMAM1（B01017070和B01020647）和2個BoMAM3（B01017071和B01037823）。

關鍵詞：十字花科植物；甘藍；硫代葡萄糖苷；GS-Elong

中圖分類號：S635：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942（2016）03—0005—04

甘藍（BrCLssica oleracea L.）為十字花科蕓薹屬植物，源于地中海至北海沿岸，是世界上廣泛種植培育的一種蔬菜，具有較高的經濟和食用價值。隨著生活水平的提高，人們對蔬菜作物的營養(yǎng)品質及保健作用要求也逐漸提高。甘藍類蔬菜作物是人們公認的抗癌蔬菜之一，其抗癌活性主要來源于包括異硫氰酸鹽在內的硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷（Glucosinolate）簡稱硫苷，又叫芥子油苷（Mustard oil glucoside），是植物中一種富含硫和氮的次生代謝產物。目前已明確結構的硫苷至少有120種，其中大多數(shù)分布于十字花科植物中，它們作為風味物質存在于十字花科蔬菜和調味類作物中而被人類社會認識已久。在近幾十年中人們漸漸發(fā)現(xiàn)，這種含氮和硫的植物次生代謝物質具有抗癌、生物殺菌和保護植物作用，其重要性越來越受到人們的重視和關注。例如，保健蔬菜西蘭花中的抗癌活性物質蘿卜硫素（Sulforaphane）就是4-甲基亞磺酰丁基硫苷（Glucoraphanin，GRA）的降解產物。

通過對擬南芥中控制脂肪族硫苷側鏈長度的GS-Elong QTL位點的克隆，人們發(fā)現(xiàn)了三個基因MAM1、MAM2和MAM3。研究發(fā)現(xiàn)，MAM1在側鏈延伸的前3個循環(huán)中具有催化作用，MAM2僅對第1個循環(huán)起作用，而MAM3負責前6個循環(huán)?；蚯贸@示，MAM2只對參與1次側鏈延伸的脂肪族硫苷生成具有重要作用，MAMl主要控制參與2次側鏈延伸循環(huán)的脂肪族硫苷的合成，MAM3則可以生成所有長度的脂肪族硫苷，但特別容易生成發(fā)生1次、5次和6次循環(huán)的硫苷。在所有的擬南芥基因型中，僅有1個（Sorbo）同時存在MAMl和MAM2，其它的只含有MAMl和MAM2中的1個。MAM位點的多態(tài)性導致了硫苷結構的多樣性，這可能是為了更好地適應生態(tài)環(huán)境的挑戰(zhàn)。

CS-Elong位點負責擬南芥和蕓薹屬植物中占主導地位的3或4碳脂肪族硫苷的產生，在Streptanthus中，GS-Elong位點也負責5碳硫苷的生成，在其它物種中甚至負責更長碳鏈硫苷的合成，這可能是由位點的進化引起的。GS-Elong位點基因編碼MAM酶家族，該酶家族既直接影響硫苷側鏈長度，也通過控制GS-PRO位點進一步影響硫苷側鏈不同基團的形成。

CS-Elong的功能在擬南芥中研究得比較透徹，但在甘藍中的研究很少。本研究主要以生物信息學分析為主要技術手段，充分詳細地挖掘甘藍EST數(shù)據(jù)庫，并對甘藍GS-Elong候選基因進行預測分析和討論，為甘藍GS-Elong基因的克隆以及硫苷甘藍新品種的選育提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

擬南芥GS-Elong位點基因（At5g23010、At5g23020和AJ486899）均來源于TAIR（www.ar-abidopsis.org）和NCBI數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）；甘藍基因組及基因注釋數(shù)據(jù)庫來源于NCBI（http：∥Brassicadb.org）；白菜GS-Elong基因來源于BRAD（http：∥Brassieadb.org），并且參考Wang等的研究；系統(tǒng)進化樹構建所涉及蛋白序列均來源于UniProt（WWW.uniprot.org）、TAIR（www.arabidopsis.org）和BRAD（http：∥Brassi-cadb.org）。

1.2試驗方法

利用擬南芥GS-Elong基因的全長CDS及蛋白序列在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）中對甘藍基因組及注釋基因數(shù)據(jù)庫進行BLASTN及BLASTP檢索，得到具備Score≥100、E-value≤10¹⁰。和Coverage≥70%條件的甘藍注釋基因作為擬南芥GS-Elong位點基因的候選同源基因。多序列比對及聚類分析采用Mega軟件。序列一致性分析和點陣圖分別采用EMBOSS軟件包的Needle程序和Polydot程序（emboss.source-forge.net）。

2結果與分析

2.1甘藍GS-Elong位點基因的預測

針對擬南芥GS-Elong位點中3個硫苷生物合成基因（MAM1、MAM2和MAM3），采用BLASTN和BLASTP程序對甘藍基因組和44 940個注釋基因（http：∥brassicadb.org/brad/）進行檢索分析，共發(fā)現(xiàn)4個同源基因（B01020647、B01017070、B01037823和Bol017071）。

GS-Elong位點基因是脂肪族硫苷側鏈延伸的直接作用基因，擬南芥中該位點存在的3個旁系同源基因MAM1、MAM2和MAM3均位于第5號染色體，并且MAM1（At5g23010）與MAM3（At5g23020）為tandem基因。甘藍中該位點預測的4個基因中的2個tandem基因B01017070和B01017071位于第6號染色體，另外2個基因B01020647和B01037823分別位于第3號和第4號染色體。

2.2甘藍與擬南芥GS—Elong位點基因的同源比較

經在核酸水平上的一致性比較發(fā)現(xiàn)，甘藍和擬南芥GS-Elong位點基因高度同源（表1），擬南芥3個旁系同源基因問的一致性在82.7%～97.2%之間，其中MAM1和MAM2間的一致性高達97.2%。甘藍4個旁系同源基因與擬南芥同源基因的一致性維持在66.1%～84.3%之間；其中B01017070、B01020647與擬南芥同源基因問的一致性較高，均在80%以上；B01037823與擬南芥同源基因問一致性次之，在72.5%以上；B01017071與擬南芥同源基因問的一致性最低，維持在66%左右。甘藍4個旁系同源基因問的一致性保持在62.0%～83.7%之間，其中B01017071與甘藍中其他同源基因存在62.0%～67.3%的一致性，其他3個同源基因間的一致性則維持在比較高的水平（73.8%～83.7%）。

2.3擬南芥和甘藍GS-Elong位點基因結構比較

擬南芥與甘藍GS-Elong位點同源基因結構比較如圖1所示，6個基因整體結構較為類似，尤其是外顯子數(shù)目和大小高度一致，只有B01017071和B01037823分別較擬南芥GS-Elong位點基因少3個和1個外顯子，內含子的大小是導致各GS-Elong位點基因全長存在較大差異的主要原因。

擬南芥和甘藍GS-Elong位點在基因外顯子數(shù)目、大小及所占基因比例等方面的比較如表2所示，擬南芥MAM1和MAM3均包含10個外顯子，并且其全基因長度、CDS長度、CDS所占全基因的比例均較為一致，僅在Exon10上MAM1較MAM3多9個堿基。甘藍GS-Elong位點的4個基因在全基因長度方面差異較大，B01037823最長，為4258 bp；B01017070最短，為2795 bp。擬南芥和甘藍GS-Elong位點CDS長度差別不大，B01017070最長，為1 527 bp；B01017071最短，為1236 bp。B01017070、B01017071、B01020647和B01037823分別含有10、7、10和9個外顯子。B01017070的Exonl～Exon8與擬南芥GS-Elong位點基因大小一致，僅在Exon9和Exon10中稍有差別；B01017071缺少Exon7、Exon8和Exon10，另外Exonl和Exon9較擬南芥GS-Elong位點基因分別少15和3個堿基；B01020647的Exon2～Ex-on9與擬南芥GS-Elong位點基因大小一致，而Exonl少12個堿基，Exon10稍長于擬南芥GS-Elong位點基因；B01037823在Exon2、Exon3、Ex-or6～Exon9與擬南芥GS-Elong位點基因保持一致，但缺少Exon4，另外，Exonl和Exonl0較短。擬南芥和甘藍GS-Elong位點基因CDS所占全基因的比例在各基因間存在較大差別，其中擬南芥MAM1和MAM3所占比例相差較小，分別為40.00%和40.66%；而甘藍4個基因的比例范圍相差較大，為30.58%～54.63%，其中B01037823最小，B01017070最大。

2.4 GS-Elong位點基因的系統(tǒng)進化分析

對擬南芥（AT）、白菜（CC）和甘藍（B0）3個已有參考基因組物種的GS-Elong位點蛋白序列進行系統(tǒng)聚類分析，結果（圖2）顯示，擬南芥MAM1與MAM2親緣關系較近，與MAM3親緣關系相對較遠。參考甘藍和擬南芥基因組、甘藍和白菜基因組間的共線性，初步確定甘藍中分別存在2個BoMAM1（Bo1017070和Bo1020647）和2個BoMAM3（Bo1017071和Bo1037823）。

3小結與討論

本研究借助生物信息學分析技術，在甘藍GS-Elong位點預測到4個旁系同源候選基因（Bol020647、Bol017070、Bol037823和Bol017071）。甘藍和擬南芥GS-Elong位點同源基因間在核酸水平上的一致性為66.1%～84.3%；甘藍GS-Elong位點4個旁系同源問的一致性保持在62.0%～83.7%之間。甘藍和擬南芥GS-Elong位點基因在外顯子數(shù)目、大小方面高度一致，但其中2個甘藍GS-Elong位點基因Bol017071和B01037823分別較擬南芥GS-Elong位點基因少3個和1個外顯子。系統(tǒng)進化及共線性分析初步確定，甘藍中分別存在2個BoMAM1（Bol017070和Bol020647）和2個BoMAM3（Bol017071和Bol037823）。

擬南芥、甘藍和白菜基因組大小分別為157、520 Mb和485 Mb。有研究表明白菜和甘藍基因組存在多倍化事件，與多倍化事件理論上伴隨的同源基因多拷貝現(xiàn)象相呼應，在擬南芥中存在3個MAM旁系同源基因（其中MAM2僅在擬南芥1個生態(tài)型中出現(xiàn)），在白菜中發(fā)現(xiàn)了7個旁系同源基因（http：∥Brassicadb.org），本研究在甘藍中發(fā)現(xiàn)4個旁系同源基因。本研究結果為利用生物技術手段人為操縱甘藍中有益硫苷的結構和數(shù)量、創(chuàng)制甘藍新品種及今后甘藍基因組學的研究奠定基礎。