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摘 要 纖維素酶是重要的水解酶，對植物的生長發(fā)育及新陳代謝發(fā)揮著重要作用。為了解茶樹中纖維素酶的活性變化特征，以茶樹品種‘鳧早2號為研究對象，測定其不同組織結(jié)構(gòu)中纖維素酶3種主要組分內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性。結(jié)果顯示，內(nèi)切葡聚糖酶在茶樹一芽四葉中隨著葉片成熟度增加，酶活性增加，表現(xiàn)為：第四葉>第三葉>第二葉>第一葉>芽，與β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)相反趨勢；外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶都是在第四葉活性最低。內(nèi)切葡聚糖酶在茶樹花朵中活性最高，而外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶分別在葉片、果皮中活性最高。胞質(zhì)蛋白中內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性顯著高于膜蛋白中的酶活性，但胞質(zhì)蛋白、膜蛋白中都未檢測到外切葡聚糖酶活性。

關(guān)鍵詞 茶樹；組織器官；亞細胞結(jié)構(gòu)；纖維素酶 ；酶活性

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A

纖維素酶是一類多組分的復(fù)合酶系，各組分間具有協(xié)同作用，能夠?qū)⒗w維素降解成葡萄糖[1]。纖維素酶做為一種細胞壁水解酶，在植物整個生長發(fā)育期間都有重要作用[2]。目前根據(jù)酶的作用方式不同，纖維素酶主要分為3 種：內(nèi)切葡聚糖酶（endo-glucanase，EG）、外切葡聚糖酶（exo-glucanase，EXG）以及β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BG）。內(nèi)切葡聚糖酶與植物的組織生長、器官成熟、果實脫落密切相關(guān)[3]；外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶都能通過糖基化反應(yīng)參與植物的生長發(fā)育過程[4]。

茶樹是中國重要的經(jīng)濟作物，主要生長在氣候濕熱的熱帶、亞熱帶地區(qū)。茶樹生長發(fā)育周期中以及后期的茶葉加工過程容易受多種因素影響，而纖維素酶就是影響因素之一。β-葡萄糖苷酶能夠催化茶樹糖苷類香氣前體的水解反應(yīng)，與芳樟醇、香葉醇等香氣物質(zhì)的生成密切相關(guān)，其產(chǎn)生的茶樹香氣物質(zhì)不僅參與茶樹對病蟲害的防御反應(yīng)，還是茶葉重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[5-6]。在烏龍茶加工過程中，做青前期有效地發(fā)揮纖維素酶的活性，不僅可以促使可溶性糖類較多的積累，而且可以破壞細胞間的胞壁區(qū)隔，促進水分和物質(zhì)轉(zhuǎn)運，并激發(fā)后續(xù)反應(yīng)，從而為茶葉奠定物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。

目前，纖維素酶組分之一的β-葡萄糖苷酶在茶樹中的研究很豐富，而關(guān)于茶樹的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的研究幾乎未見報道。已知纖維素酶各組分間存在協(xié)同作用，對茶樹的影響是一系列的復(fù)雜反應(yīng)，因此本研究通過分析其3個主要組分在茶樹嫩梢不同部位及不同組織器官中的活性變化，并從亞細胞結(jié)構(gòu)方面分析纖維素酶活性在茶樹葉片細胞中的差異，希望為研究纖維素酶對茶樹生長發(fā)育的影響及在茶葉加工過程中的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2015年9月份在本實驗室及試驗茶園進行，以試驗茶園中的茶樹[Camellia sinensis （L.）O. Kuntze]品種‘鳧早2號為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 茶樹粗酶液的提取 稱取茶樹葉片、花、莖、果皮及種胚等新鮮樣品2 g，加入冰鎮(zhèn)的20 mL 100 mmol/L檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液（pH5.0），以及等量的聚乙烯吡咯烷酮（Polyvingypyrrolidone，PVPP）和0.5 g石英砂，在冰上用研缽迅速研磨至勻漿。勻漿液在8 000×g下低溫離心5 min ，取上清液再以10 000×g 低溫離心10 min，上清液即為茶樹組織粗酶液[8]。

1.2.2 纖維素酶各組分活性測定方法 內(nèi)切葡聚糖酶活性測定采用DNS（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）試劑法，將200 μL茶樹樣品粗酶液、200 μL 5 g/L羧甲基纖維素鈉（內(nèi)切葡聚糖酶底物）和600 μL 100 mmol/L檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液（pH5.0）加入10 mL離心管中，49 ℃保溫3 h后，加入3 mL DNS試劑，煮沸10 min進行顏色反應(yīng)。將待測樣品反應(yīng)前加3 mL DNS試劑并煮沸10 min設(shè)為對照，所有樣品用紫外分光光度儀于540 nm下測吸光值[9]。外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶活性測定時，底物為10 mmol/L PNPC（4-Nitrophenyl-beta-D-cellobioside，

PNPC）和10 mmol/L p-NPG（4-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，p-NPG），反應(yīng)體系及條件與內(nèi)切葡聚糖酶相同，反應(yīng)結(jié)束后，加入2.5 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，用紫外分光光度儀于405 nm下測定吸光值，將待測樣品反應(yīng)前加2.5 mL Na2CO3設(shè)為對照[10-11]。

1.2.3 酶活性計算方法 內(nèi)切葡聚糖酶活性計算方法：利用還原糖標準曲線計算出反應(yīng)體系中生成的葡萄糖含量，以每毫升粗酶液每10 min催化生成1 μmol葡萄糖為1個酶活單位。外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶活性計算方法：用對硝基苯酚標準曲線計算出反應(yīng)體系中生成的對硝基苯酚含量，以每毫升粗酶液每10 min催化生成1 μmol對硝基苯酚為1個酶活單位。

1.2.4 茶樹葉片胞質(zhì)蛋白、膜蛋白分離提取及SDS-PAGE電泳 利用膜蛋白分級分離和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒（FOCUSTM Global Fractionation，G-Biosciences）分離提取茶樹葉片細胞全蛋白中胞質(zhì)蛋白、膜蛋白，方法與步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。蛋白電泳采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），以考馬斯亮藍R-250染色[12]，用凝膠成像系統(tǒng)BIORAD Gel DOCTM XR拍照分析，蛋白圖譜采用BIORAD凝膠定量軟件Quantity one將條帶標出。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹一芽四葉不同部位中纖維素酶活性分析

如圖1所示，茶樹一芽四葉不同部位中酶活性變化趨勢為：內(nèi)切葡聚糖酶隨著茶樹葉片成熟度的增加，酶活性增加，在第四葉中酶活性最高，為單芽中酶活的 3.16倍，整體趨勢表現(xiàn)為第四葉>第三葉>第二葉>第一葉>芽；外切葡聚糖酶活性在第二葉中最高，分別是第三葉、第四葉中酶活的1.36、2.15倍；β-葡萄糖苷酶活性在單芽中活性最高，隨著葉片成熟度增加，酶活性緩慢降低，第四葉中酶活性為單芽中的82.95%。整體看來，在茶樹嫩梢不同部位中內(nèi)切葡聚糖酶活性變化趨勢與外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶存在負相關(guān)性，另外，在同等反應(yīng)體系及條件下，茶樹新梢中β-葡萄糖苷酶活性比外切葡聚糖酶活性高。

2.2 茶樹不同組織器官中纖維素酶活性變化

如圖2所示，茶樹花朵中內(nèi)切葡聚糖酶活性比其他部位強烈，尤其是完全展開的花朵中酶活性最高，為3.51U/（10 min·mL），分別是葉片、莖段、果皮的13.67、72.41、15.23倍，而外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶在花朵中的活性則比較低。外切葡聚糖酶在茶樹葉片中的酶活性高于其他組織器官。β-葡萄糖苷酶活性在果皮中有最高值，但是在茶樹果皮中卻無法檢測到外切葡聚糖酶活性。另外對茶樹種胚中的纖維素酶活性進行檢測，卻無法檢測到各組分的酶活性，這與種胚中的內(nèi)含物，如大量的淀粉相關(guān)，導(dǎo)致粗酶液呈現(xiàn)渾濁而無法檢測。

2.3 茶樹葉片細胞膜蛋白、胞質(zhì)蛋白分離提取與纖維素酶活性分析

利用試劑盒分離提取茶樹葉片細胞中胞質(zhì)蛋白（SPE）和膜蛋白（MPE），后進行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果表明SPE與MPE的SDS-PAGE電泳圖譜相似，主要條帶均有7個，其分子量相似（圖3）。酶活性測定中，SPE與MPE中可以檢測到內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，但是未能檢測到外切葡聚糖酶的活性。MPE中內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性分別是SPE中的44.29%、38.75%，顯著低于SPE。

3 討論與結(jié)論

3.1 茶樹不同組織器官中纖維素酶的活性差異

內(nèi)切葡聚糖酶基因在植物的不同發(fā)育階段均可以被誘導(dǎo)表達，如植物的開花、果實成熟及其器官脫落等過程。 草莓EG基因Cel1在果實成熟過程中特異表達[13]；而擬南芥EG基因Cel1則在正在伸展的幼嫩組織中表達[14]。番茄內(nèi)切葡聚糖酶基因cel5和cel6與花的脫落有關(guān)，不同的是cel6在花脫落整個過程中有持續(xù)表達，而cel5只在花脫落后期中有表達[15]。本研究結(jié)果表明花朵中內(nèi)切葡聚糖酶活性強烈，與其他組織器官中酶活性相比差異顯著，尤其是完全展開的花朵中酶活性最高，這與前面研究報道的結(jié)論相一致[13-15]。β-葡萄糖苷酶在植物種子中含量最多，尤其是發(fā)芽部位、幼嫩組織和子葉基部[16]。茶樹葉片中β-葡萄糖苷酶活性在秋季高，春季低，在幼嫩部位活性高[17-18]。本試驗中β-葡萄糖苷酶在果皮中的酶活相比其他組織器官有顯著性差異，與內(nèi)切葡聚糖酶活性在芽葉部位呈：現(xiàn)相反趨勢，內(nèi)切葡聚糖酶活性高低趨勢為：芽<第一葉<第二葉<第三葉<第四葉，而β-葡萄糖苷酶活性趨勢為：芽>第一葉>第二葉>第三葉>第四葉，這與內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因表達特性有關(guān)，后續(xù)實驗中可通過基因表達量分析兩者之間的酶活性差異。

本試驗結(jié)果表明外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶在同一反應(yīng)體系及條件下酶活性顯著差異，表現(xiàn)出外切葡聚糖酶活性在各個茶樹組織器官中活性均比β-葡萄糖苷酶活性低。Nigorikawa等[19]在水稻中的研究表明：如果過量表達外切葡聚糖酶基因，雖然纖維素酶活性增加，水稻各組織中的糖分也會增加，但是轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片、葉脈以及葉綠體都出現(xiàn)不同程度的缺陷變異，同時有部分植株出現(xiàn)不育；而過量表達β-葡萄糖苷酶基因，轉(zhuǎn)基因植株與野生型在生長發(fā)育過程以及果實成熟過程中無差異，并且不會引起轉(zhuǎn)基因水稻在形態(tài)上的變異。如果過量表達內(nèi)切葡聚糖酶，則無法獲得轉(zhuǎn)基因植株，過量表達的內(nèi)切葡聚糖酶對水稻再生體系存在毒害作用。這些結(jié)果表明，纖維素酶對植物生長發(fā)育的重要性，同時也揭示3個組分內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶植物生長發(fā)育中所扮演的角色重要性不同，如Rodrigues等[20]研究表明內(nèi)切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶的協(xié)同水解作用時，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶含量與水解生成的生物量成正比；內(nèi)切葡聚糖酶含量不會限制水解速率，而β-葡萄糖苷酶含量是影響水解速率的決定因素。

3.2 茶樹亞細胞結(jié)構(gòu)中纖維素酶的活性差異

擬南芥內(nèi)切葡聚糖酶家族基因分為3個亞類（α，β和γ），不同亞類調(diào)控著不同的生理生長過程 ，其中α亞類基因AT1G70710被定位于細胞的葉綠體和胞外區(qū)；γ亞家族基因含有與細胞質(zhì)膜相關(guān)的蛋白域，并與膜結(jié)合的纖維素合成酶一起參與纖維素的合成[1]。植物中的 β-葡萄糖苷酶基因多被定位在質(zhì)體、質(zhì)膜、細胞質(zhì)、液泡及線粒體基質(zhì)等亞細胞器官中表達[21-22]。茶樹 β-葡萄糖苷酶基因mNRA在細胞質(zhì)中有表達信號[23]。玉米外切葡聚糖酶基因ExGase在細胞壁與細胞膜中均有表達[24]。這些結(jié)果表明，纖維素酶相關(guān)基因在細胞膜、細胞質(zhì)中均有表達。在本試驗結(jié)果中，茶樹葉片胞質(zhì)蛋白與膜蛋白中能夠檢測到內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，卻無法檢測到外切葡聚糖酶活性，可能是通過此方法提取的蛋白中外切葡聚糖酶活性太低而無法通過分光光度計檢測到。另外，胞質(zhì)蛋白中內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性顯著高于膜蛋白中酶活，這也許與內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶基因家族在亞細胞中的定位及表達量有關(guān)，也可能與蛋白提取過程中相關(guān)，先提取胞質(zhì)蛋白，而后進行膜蛋白的提取，造成膜蛋白中的酶活性降低。

參考文獻

[1] Libertini E， Li Y M S. Phylogenetic analysis of the plant endo-beta-1，4-glucanase gene family[J]. J Mol Evol， 2004， 58（5）： 506-515.

[2] Roberts J A， Elliott K A， Gonzalezcarranza Z H. Abscission， dehiscence， and other cell separation processes[J]. Annu Rev Plant Biol， 2002， 53（1）： 131-58.

[3] Molhoj M， Pagant S， Hofte H. Towards understanding the role of membrane-bound endo-beta-1，4-glucanases in cellulose biosynthesis[J]. Plant Cell Physiol， 2002， 43（12）： 1 399-1 406.

[4] Furukawa K， Ichikawa S， Nigorikawa M， et al. Enhanced production of reducing sugars from transgenic rice expressing exo-glucanase under the control of a senescence-inducible promoter[J]. Transgenic Res， 2014， 23（3）： 1-7.

[5] 周漢琛， 雷攀登， 丁 勇. 茶樹β-葡萄糖苷酶研究進展[J]. 茶葉科學(xué)， 2016， 36（2）： 111-118.

[6] Yang Z， Baldermann S， Watanabe N. Recent studies of the volatile compounds in tea[J]. Food Res Int， 2013， 53（2）： 585-599.

[7] 唐 顥， 楊偉麗， 文海濤. 烏龍茶加工中纖維素酶的活性與相關(guān)生化成分的動態(tài)變化[J]. 貴州茶葉， 2003（2）： 19-21.

[8] 江昌俊， 李葉云. 茶芽葉中β-葡萄糖苷酶活性的日變化（簡報）[J]. 植物生理學(xué)報， 2000（4）： 324-326.

[9] 張樹河， 謝志君， 林一心， 等. 利用能源植物斑茅纖維固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶及其糖化的研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2011， 32（12）： 2 346-2 351.

[10] 江昌俊，李葉云. 茶葉中β-D-葡萄糖苷酶活性測定條件的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 1999（2）： 212-215.

[11] 李志強， 廖祥儒， 陸 芳. 碧桃[（Prunus persicaL.）葉中β-葡萄糖苷酶的分離純化和某些特性分析[J]. 植物生理學(xué)報， 2007， 43（2）： 359-362.

[12] 周瓊瓊，孫威江. 茶樹總蛋白質(zhì)提取方法及雙向電泳體系的建立[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2014， 35（8）： 1 517-1 522.

[13] Woolley L C， James D J， Manning K. Purification and properties of an endo-beta-1， 4-glucanase from strawberry and down-regulation of the corresponding gene， cel1[J]. Planta，2001， 214（1）： 11-21.

[14] Ziv S， Mara D， Levava R， et al. Expression of endo-1，4-β-glucanase（cel1）in Arabidopsis thaliana is associated with plant growth， xylem development and cell wall thickening[J]. Plant Cell Rep， 2006， 25（10）： 1 067-1 074.

[15] Campillo E D， Bennett A B. Pedicel breakstrength and cellulase gene expression during tomato flower abscission[J]. Plant Physiol， 1996， 111（3）： 813-820.

[16] Mkpong O E， Sayre R T. Purification， characterization， and localization of linamarase in cassava[J]. Plant Physiol， 1990， 93（1）： 176-181.

[17] 陳 亮， 趙麗萍， 馬春雷， 等. 茶樹β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶基因表達差異分析[J]. 園藝學(xué)報， 2009， 36（1）： 87-92.

[18] 駱耀平， 董尚勝， 童啟慶，等. 7個茶樹品種新梢生育過程中β-葡萄糖苷酶活性變化[J]. 茶葉科學(xué)， 1997（S1）： 25-28.

[19] Nigorikawa M， Watanabe A， Furukawa K， et al. Enhanced saccharification of rice straw by overexpression of rice exo-glucanase[J]. Rice， 2012， 5（1）： 14-14.

[20] Rodrigues M A， Teixeira R S S， Bon E P D S. Untreated Chlorella homosphaera biomass allows for high rates of cell wall glucan enzymatic hydrolysis when using exoglucanase-free cellulases[J]. Biotechnol Biofuel， 2015， 8（1）： 1-16.

[21] Xu Z， Escamilla-Trevino L， Zeng L， et al. Functional genomic analysis of Arabidopsis thaliana glycoside hydrolase family 1[J]. Plant Mol Biol， 2004， 55（3）： 343-367.

[22] Gómez-Anduro G， Ceniceros-Ojeda E A， Casados-Vázquez L E， et al. Genome-wide analysis of the beta-glucosidase gene family in maize（Zea mays L. var B73）[J]. Plant Mol Biol，2011， 77（1-2）： 159-183.

[23] 李遠華， 江昌俊， 余有本. 茶樹β-葡萄糖苷酶基因mRNA的表達[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2005， 28（2）： 103-106.

[24] Kim J B， Olek A T， Carpita N C. Cell wall and membrane-associated exo-beta-D-glucanases from developing maize seedlings[J]. Plant Physiol， 2000， 123（2）： 471-485.