張燕梅 李俊峰 陸軍迎 鹿志偉 周文釗

摘 要 玻璃化問(wèn)題是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的普遍現(xiàn)象，已成為植物組織快速繁殖的瓶頸。本研究以H.11648為材料，分析H.11648不定芽玻璃化過(guò)程中氣孔形態(tài)、DNA含量、葉片含水量、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量以及過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）等防御酶活性變化情況，結(jié)果表明：玻璃化后的不定芽葉片保衛(wèi)細(xì)胞膨大，氣孔變大。體細(xì)胞DNA含量沒(méi)有變化，但細(xì)胞數(shù)減少。隨著玻璃化程度的增加，葉片含水量顯著增加，可溶性蛋白和丙二醛含量明顯降低，POD活性顯著上升，SOD活性先上升后又略有下降，但均顯著高于正常水平，APX活性先明顯上升后又恢復(fù)到正常水平，CAT活性略有下降但不顯著。本研究為揭示劍麻不定芽玻璃化的生理機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞 劍麻；不定芽；玻璃化

中圖分類(lèi)號(hào) S563.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Hyperhydricity is a serious problem during in vitro culture of plant， and it is considered as a bottleneck to micropropagation of plants. Stomata form and DNA content， water content， concentrations of soluble protein and malonyldialdehyde， the activities of antioxidative enzymes， e.g. peroxidase（POD）， catalase（CAT）， ascorbate peroxidase（APX）and superoxide dismutase（SOD）， were examined in adventitious shoots of H.11648. The results showed that guard cell expanded and the pore surrounded by the guard cues in hyperhydric leaves were more rounded in contrast to the elliptical pore in normal leaves. The DNA content was not changed while cell number decreased after hyperhydriciting. Hyperhydric shoots had higher water content，lower soluble protein and MDA concentration than normal shoots. The activities of antioxidant enzymes， such as POD and SOD significantly increased in hyperhydric shoots than in healthy shoots. CAT showed a slight decrease in activity in the hyperhydric leaves than in healthy leaves， APX activity significantly increased at H1 stage and then recovered normal levels at H2 stage. The results would provide a reference for revealing the physiological mechnism of hyperhydricity of adventitious shoots of H.11648.

Key words H.11648； Adventitious shoots； Hyperhydricity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.010

劍麻是一種極具特色的熱帶纖維作物，它不僅是主要的熱帶纖維原料[1]，同時(shí)劍麻莖心也是釀造龍舌蘭酒的主要原料[2]。此外，劍麻汁液含有較高皂素，可用來(lái)制藥[3]，同時(shí)劍麻也可視為是一種重要的生物質(zhì)能源作物[4-5]，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。劍麻是營(yíng)養(yǎng)體繁殖為主的植物，組培快繁是其重要的繁殖手段之一，然而，在劍麻植株再生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不定芽玻璃化比較嚴(yán)重，玻璃化的植株常呈透明或半透明水漬狀，葉片卷曲、膨大變厚且易碎，最終因無(wú)法正常生長(zhǎng)而死亡[6-7]（圖1-c）。張燕梅等[8]曾通過(guò)改良培養(yǎng)基來(lái)克服劍麻再生植株玻璃化問(wèn)題，但對(duì)于引起玻璃化的原因及機(jī)制還不是十分清楚。針對(duì)上述現(xiàn)象，本研究從生理和細(xì)胞學(xué)水平對(duì)玻璃化的劍麻進(jìn)行了研究，旨在為探討劍麻玻璃化的發(fā)生機(jī)理和控制玻璃化的發(fā)生提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以主栽品種H.11648為試材，將其愈傷組織接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基參照張燕梅等[9]的方法。待不定芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，采取葉片并按照玻璃化程度進(jìn)行分級(jí)，其中0級(jí)為正常不定芽（H0），Ⅰ級(jí)為葉片玻璃化面積占總面積的1/2及以下（H1），Ⅱ級(jí)為葉片玻璃化面積占總面積的1/2以上（H2）（圖1）。

1.2 方法

1.2.1 含水量測(cè)定 分別取0級(jí)、Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的葉片1 g（G0），裝入牛皮紙袋中，于80 ℃烘箱中烘干至恒重（G1），按下式計(jì)算葉片含水量：

葉片含水量/（g/g FW）=[（G0-G1）/G0]×100%

1.2.2 可溶性蛋白含量（μg/g）測(cè)定 分別取0級(jí)、Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)劍麻葉片0.5 g，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行測(cè)定，具體參照高俊鳳[10]的方法。

1.2.3 葉片下表皮氣孔特征觀(guān)察 取0級(jí)、Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)劍麻葉片，在顯微鏡（Nikon ECLIPSE 80i）下觀(guān)察葉片下表皮氣孔特征。具體參照張燕梅等[11]的方法。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取0級(jí)、Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)劍麻不定芽，采用流式細(xì)胞儀（Beckman）測(cè)定正常不定芽與玻璃化不定芽體細(xì)胞DNA的相對(duì)含量。具體參照Palomino等[12]方法進(jìn)行。DNA含量由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所檢測(cè)。

1.2.5 防御酶活性測(cè)定 分別取0級(jí)、Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的劍麻不定芽0.5 g，加入2 mL提前預(yù)冷的酶液提取液后于冰浴下研磨成漿，再加提取液沖洗2～3次（總體積為5 mL），轉(zhuǎn)入離心管中，于4 ℃ 10 000 r/min下離心15 min，取上清液分裝后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定參考孫云等[13]的方法，以每分鐘氧化1 μmol抗壞血酸（AsA）的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定參照南京建成公司的SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以每克鮮樣中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)酶活單位（U）。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用比色法，具體參照劉琳等[14]的方法，以每分鐘內(nèi)A240變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，具體參照鄒琦[15]的方法進(jìn)行，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。丙二醛（MDA）的含量測(cè)定參照Wang等[16]的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述所有數(shù)據(jù)均采用SAS分析軟件統(tǒng)計(jì)并進(jìn)行差異顯著性分析（p≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 玻璃化過(guò)程中含水量變化情況

正常不定芽（H0）含水量為93.215%，部分玻璃化后的不定芽（H1）含水量為95.457%，玻璃化后的不定芽（H2）含水量為97.09%，玻璃化后的不定芽含水量顯著高于正常不定芽含水量。在整個(gè)玻璃化過(guò)程中，不定芽含水量呈現(xiàn)明顯遞增趨勢(shì)（圖2）。

2.2 玻璃化過(guò)程中可溶性蛋白變化情況

正常不定芽（H0）可溶性蛋白含量為258.007 μg/g，部分玻璃化的不定芽（H1）可溶性蛋白含量為205.773 μg/g，玻璃化后的不定芽（H2）可溶性蛋白含量為178.282 μg/g，玻璃化后的不定芽可溶性蛋白顯著低于正常不定芽可溶性蛋白。在整個(gè)玻璃化過(guò)程中，不定芽可溶性蛋白呈現(xiàn)明顯遞減趨勢(shì)（圖3）。說(shuō)明在玻璃化過(guò)程中，蛋白質(zhì)合成減少，分解速率增加。

2.3 玻璃化過(guò)程中MDA含量變化情況

正常不定芽（H0）MDA含量為0.001 3 μmol/g，部分玻璃化（H1）時(shí)MDA含量明顯下降，為0.000 9 μmol/g，但不定芽完全玻璃化（H2）時(shí)，MDA又略有上升，為0.001 2 μmol/g，在整個(gè)玻璃化過(guò)程中表現(xiàn)為先下降然后又恢復(fù)到正常水平（圖4）。

2.4 葉片下表皮氣孔特征觀(guān)察

顯微鏡觀(guān)察顯示：正常葉片下表皮細(xì)胞呈長(zhǎng)條形，排列整齊致密，2個(gè)腎形保衛(wèi)細(xì)胞位于2個(gè)表皮細(xì)胞的交聯(lián)處，氣孔長(zhǎng)條形，氣孔和2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞組成一個(gè)紡錘體形，放大后可看到大量的葉綠體整齊地排列在保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)（圖5-a，5-d）。完全玻璃化（H2）后的葉片下表皮細(xì)胞明顯比正常葉片下表皮細(xì)胞短、粗，保衛(wèi)細(xì)胞膨脹并向內(nèi)彎曲，氣孔變大，氣孔和2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞組成一個(gè)球形。保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)也明顯減少（圖5-c，5-f）。部分玻璃化的葉片下表皮細(xì)胞則處于兩者之間，細(xì)胞有長(zhǎng)條形，也有粗壯形，葉綠體減少不明顯（圖5-b，5-e）。另外，在單個(gè)視野內(nèi)，氣孔密度H0>H1>H2（圖5-a，5-b，5-c）。

2.5 體細(xì)胞DNA相對(duì)含量測(cè)定

如圖6所示：正常不定芽（H0）在熒光強(qiáng)度為55處出現(xiàn)了一個(gè)單峰（圖6-a），玻璃化的不定芽（H2）在55處出現(xiàn)了一個(gè)單峰（圖6-b），即在不定芽玻璃化過(guò)程中，體細(xì)胞DNA相對(duì)含量沒(méi)有發(fā)生變化。在相同條件下，正常不定芽細(xì)胞數(shù)約500，玻璃化后的不定芽細(xì)胞數(shù)為280，即玻璃化后的細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞分裂減慢。

2.6 玻璃化過(guò)程中抗氧化酶APX、POD、CAT和SOD變化情況

劍麻不定芽玻璃化過(guò)程中4種抗氧化酶APX、POD、CAT和SOD變化情況如表1所示。正常不定芽APX活性為4 944.762 μmol/（g·min），在H1時(shí)顯著上升，達(dá)到最高值6 665.357 μmol/（g·min），在H2時(shí)又略有下降，為4 420.952 μmol/（g·min），但與H0相比，降低不顯著，在整個(gè)玻璃化過(guò)程中，APX活性呈現(xiàn)先上升后下降。CAT活性在整個(gè)玻璃化過(guò)程中呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，正常不定芽CAT活性為3 322.000 U/（g·min），H1時(shí)為2 837.778 U/（g·min），H2時(shí)為2 712.444 U/（g·min），隨著玻璃化程度的增加，其活性下降但不顯著。POD酶活性在玻璃化過(guò)程中呈遞增趨勢(shì)，在H0時(shí)為904.271 U/（g·min），H1時(shí)為1 340.486 U/（g·min），H2時(shí)最高，為2 102.343 U/（g·min），完全玻璃化后的不定芽POD顯著高于正常不定芽。SOD酶活性在玻璃化過(guò)程中則先升高后下降，H0時(shí)為17.577 U/g，H1時(shí)最高，為29.713 U/g，H2又略有減低，為24.613 U/g，玻璃化后的不定芽（H1和H2）SOD酶活性均顯著高于正常不定芽。

3 討論與結(jié)論

玻璃化是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的普遍現(xiàn)象，在瑪珈[16]、甜櫻桃[17]、康乃馨[18]、擬南芥[19]、蘋(píng)果[20]、大蒜[21]等植物中均有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)H.11648不定芽玻璃化過(guò)程中含水量增加，氣孔變大且無(wú)法正常關(guān)閉。關(guān)于含水量與玻璃化的關(guān)系較為復(fù)雜，van den Dries等[19]認(rèn)為玻璃化的葉片質(zhì)外體腔中的水積累過(guò)多，氣體體積嚴(yán)重變小，氣體交換速率減慢，這樣反過(guò)來(lái)會(huì)使質(zhì)外體中乙烯，茉莉酸甲酯等濃度升高，從而導(dǎo)致植物玻璃化。氣孔的大小和關(guān)閉是由保衛(wèi)細(xì)胞細(xì)胞壁調(diào)控，玻璃化后的葉片保衛(wèi)細(xì)胞木質(zhì)素、纖維素等含量降低[22]，次生壁和細(xì)胞板形成受阻，細(xì)胞無(wú)法正常分裂，細(xì)胞壁也隨之受損，因此無(wú)法正確調(diào)控氣孔的關(guān)閉[23]，這與蘋(píng)果[24]、康乃馨[25]、香草[26]等研究結(jié)果一致。

流式檢測(cè)表明，在劍麻玻璃化過(guò)程中，體細(xì)胞數(shù)目減少，DNA相對(duì)含量不變。這與Franck等[17]的研究結(jié)果一致。Franck等[17]認(rèn)為細(xì)胞數(shù)目減少是由于玻璃化過(guò)程中細(xì)胞分裂頻率降低了，這樣可以防止活性氧引起的子細(xì)胞DNA的損傷。Ochatt等[27]則認(rèn)為，玻璃化能引起DNA含量的改變，但兩者之間的因果關(guān)系仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，也有學(xué)者認(rèn)為玻璃化不僅能引起DNA含量變化，還可引起染色體斷裂、重排以及DNA甲基化等[28-30]。

本研究中的劍麻不定芽玻璃化過(guò)程中MDA含量下降，POD、SOD、APX和CAT抗氧化酶活性發(fā)生明顯改變。SOD、CAT、 POD 和APX是4 個(gè)重要抗氧化酶，其中 SOD 能催化體內(nèi)的歧化反應(yīng)，使超氧陰離子自由基（O2·- ）轉(zhuǎn)化為 H2O2和O2，其在玻璃化過(guò)程中活性的顯著升高可以減少劍麻不定芽玻璃化過(guò)程中由于活性氧爆發(fā)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞膜的損害，這與Franck等[17]和Chakrabarty等[20]的研究結(jié)果一致。而POD、APX和CAT的高活性，則可進(jìn)一步將H2O2分解成沒(méi)有毒害的H2O和O2，維持H2O2的動(dòng)態(tài)平衡，抑制MDA 的積累，從而降低膜脂過(guò)氧化程度，減緩玻璃化的發(fā)生[19]。

玻璃化是一個(gè)非常復(fù)雜的生理生化過(guò)程，本研究?jī)H對(duì)劍麻不定芽玻璃化進(jìn)行了初步的探討，有關(guān)不定芽玻璃化過(guò)程中是否存在活性氧的爆發(fā)、活性氧與玻璃化的關(guān)系以及引起劍麻不定芽玻璃化的生理機(jī)制則需更深入的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Iniguez-Covarrubias G， Diaz-Teres R， Sanjuan-Duenas R， et al. Utilization of by-products from the tequila industry. Part 2： potential value of Agave tequilana Weber azul leaves[J]. Bioresource Technology， 2001， 77（2）： 101-108.

[2] Martinez-Aguilar J F， Pena-Alvarez A. Charactirization of five typical agave plants used to produce mescal through their simple lipid composition analysis by gas chromatography[J]. J Agric Food Chem， 2009， 57： 1 933-1 939.

[3] Mancilla-Margalli N A， Lopez M G. Generation of Maillard compounds from inulin during the thermal processing of Agave tequilana Weber Var. azul[J]. J Agric Food Chem， 2002， 50（4）： 806-812.

[4] Chambers D， Holtum J A M. Feasibility of Agave as a feedstock for biofuel production in Australia[J]. GCB Bioenergy， 2011， 3（10）： 58-67.

[5] Borland A M， Griffiths H， Hartwell J， et al. Exploiting the potential of plants with crassulacean acid metabolism for bioenergy production on marginal lands[J]. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（10）： 2 879-2 896.

[6] Zhang Y M， Xin L， Zhi C， et al. Shoot organogenesis and plant regeneration in Agave hybrid No.11648[J]. Scientia horticulturae， 2013， 161： 30-34.

[7] Kevers C， Franck T， Strasser R J， et al. Hyperhydricity of micropropagated shoots： a typically stress-induced change of physiological state[J]. Plant Cell Tiss Org， 2004， 77（2）： 181-191.

[8] 張燕梅， 周文釗， 李俊峰， 等. 一種克服劍麻不定芽玻璃化的方法： 中國(guó)， ZL201210293863.3[P]. 2012-08-17.

[9] 張燕梅， 陳 志， 李俊峰， 等. 劍麻愈傷組織的誘導(dǎo)和再生體系的建立[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（1）： 61-66.

[10] 高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社， 2006：142-143.

[11] 張燕梅， 李俊峰， 陸軍迎， 等. 劍麻四倍體誘導(dǎo)與倍性鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（8）： 1 409-1 415.

[12] Palomino G， Dolezel J， Méndez I， et al. Nuclear genome size analysis of Agave tequilana Weber[J]. Caryologia， 2003， 56（1）： 37-46.

[13] 孫 云， 江春柳， 賴(lài)鐘雄， 等. 茶樹(shù)鮮葉抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性的變化規(guī)律及測(cè)定方法[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 29（5）：562-566.

[14] 劉 琳， 侯喜林， 王麗英， 等. 不結(jié)球白菜感染蕪箐花葉病毒后4種防御酶活性變化及其抗病相關(guān)性[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 32（3）： 14-18.

[15] 鄒 琦. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2000.

[16] Wang Y L， Wang X D， Zhao B， et al. Reduction of hyperhydricity in the culture of Lepidium meyenii shoots by the addition of rare earth elements[J]. Plant Growth Regulation， 2007， 52（2）：151-159.

[17] Franck T， Kevers C， Gaspar T， et al. Hyperhydricity of Prunus avium shoots cultured on gelrite： a controlled stress response[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2004， 42： 519-527.

[18] Saher S， Piqueras A， Hellin E， et al. Hyperhydricity in micropropagated carnation shoots： the role of oxidative stress[J]. Physiologia plantarum， 2004， 120： 152-161.

[19] van den Dries N， Giannì S， Czerednik A， et al. Flooding of the apoplast is a key factor in the development of hyperhydricity[J]. J Exp Bot， 2013， 64（16）： 5 221-5 230.

[20] Chakrabarty D， Park S Y， Ali M B， et al. Hyperhydricity in apple： Ultrastuctural and physiological aspects[J]. Tree physiology， 2005， 26（3）： 377-388.

[21] Wu Z， Chen L J， Long Y J. Analysis of ultrastructure and reactive oxygen species of hyperhydric garlic（Allium sativum L.）shoots[J]. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant， 2009， 45（4）： 483-490.

[22] Zil M， Ariel T. The relationship between cell wall deformity and stomatal malfunction in the leaves of carnation in vitro[C]. Proceedings of the International Society Congress on Plant Molecular Biology， Jerusalem： Israel， 1988： 425.

[23] Laloi C， Apel K， Danon A. Reactive oxygen signalling： the latest news[J]. Curr Opin Plant Biol， 2004， 7（3）： 323-328.

[24] Blanke M M， Belcher A. Stomata of apple leaves cultured in vitro[J]. Plant Cell Tissue Organ Cult， 1989， 19： 85-89.

[25] Meira Z I V. Quality of micropropagated plants-vitrification[J]. In Vitro Cell Dev Biol， 1991， 27： 64-69.

[26] Sreedhar RV， Venkatachalam L， Neelwarne B. Hyperhydricity-related morphologic and biochemical changes in Vanilla（Vanilla planifolia）[J]. J Plant Growth Regul， 2009， 28（1）： 46-57.

[27] Ochatt S J， Muneaux E， Machado C， et al. The hyperhydricity of in vitro regenerants of grass pea（Lathyrus sativus L.）is linked with an abnormal DNA content[J]. J Plant Physiol， 2002， 159（9）： 1 021-1 028.

[28] Bohr V A， Dianov G L. Oxidative DNA damage processing in nuclear and organellar DNA[J]. Biochimie， 1999， 81： 155-160.

[29] Cerda S， Weitzman S A. Influence of oxygen radical injury on DNA methylation[J]. Mutation Res， 1997， 386： 141-152.

[30] Kaeppler S M， Phillips R L. DNA methylation and tissue culture induced variation in plants[J]. In Vitro Cell Dev Biol， 1993， 29： 125-130.