朱迎迎 李敏 高兆銀 章武 楊冬平 陳亮

摘要：【目的】明確火龍果果實炭疽病病原菌的種類及其生物學(xué)特性，為火龍果炭疽病病害防控提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^致病性測定、形態(tài)學(xué)特征觀察及rDNA-ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析的方法對引起火龍果果實炭疽病的病原菌進行鑒定，并初步研究其生物學(xué)特性?！窘Y(jié)果】供試菌株ITS序列為576 bp，與平頭炭疽菌（登錄號：HQ896482、AF451899）、辣椒炭疽菌（登錄號：JX910365、HQ271465）的同源性均達100%；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，該菌株與平頭炭疽菌和辣椒炭疽菌具有很近的遺傳關(guān)系。該菌菌絲生長的適宜溫度為20～30 ℃，產(chǎn)孢適宜溫度為25～35 ℃，最適生長和產(chǎn)孢溫度為30 ℃，致死溫度為60 ℃處理10 min；菌絲適宜生長pH為4～9，最適pH為8，產(chǎn)孢適宜pH為4～7，最適產(chǎn)孢pH為4；最適碳源為蔗糖和D-果糖，最適氮源為牛肉膏和蛋白胨，可溶性淀粉和硝酸銨有利于該菌產(chǎn)孢；連續(xù)光照和光暗交替有利于菌絲生長，黑暗則有利于該菌產(chǎn)孢?！窘Y(jié)論】引起海南省火龍果果實炭疽病的另一種病原菌是平頭炭疽菌[C. truncatum （Schw.） Andrus & Moore]，該菌不僅侵染火龍果果實，還能侵染大豆豆莢和番茄果實。

關(guān)鍵詞： 火龍果；炭疽?。黄筋^炭疽菌；rDNA-ITS；生物學(xué)特性

中圖分類號： S436.67 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）01-0059-08

0 引言

【研究意義】火龍果（Hylocereus undulatus）又稱紅龍果，為仙人掌科量天尺屬植物，是典型的熱帶水果（鄭良永，2004）。火龍果果實外形獨特，含豐富的植物性蛋白、礦物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)等，口味佳，深受人們喜愛。近年來，隨著火龍果栽培面積的不斷擴大，其病害問題更加明顯，嚴重影響了火龍果的產(chǎn)量和品質(zhì)（胡美姣等，2010；李敏等，2012a）。炭疽病是火龍果上的一種重要病害，具有潛伏侵染性，主要危害火龍果果實，常在采后貯運時發(fā)生，造成重大經(jīng)濟損失（袁誠林等，2004；李茂和蔣昌順，2008；Phoulivong et al.，2010）。因此，對火龍果果實炭疽病病原菌進行分離、鑒定，并初步探究其生物學(xué)特性，對火龍果炭疽病的綜合防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】關(guān)于火龍果病害，前人的研究主要集中在采前田間病害防治方面，在果實采后病害方面的研究報道較少。胡美姣等（2010）對火龍果采后病害研究發(fā)現(xiàn)，膠孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）是引起火龍果果實炭疽病的主要病原菌。李敏等（2012b）對火龍果采后病害發(fā)生種類及病原菌種類進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和辣椒炭疽菌（C. capsici）是引起海南省火龍果果實炭疽病的兩種病原菌，且不同的病原菌所引起的病害癥狀不同。鄭偉等（2014）對從火龍果炭疽病病株上分離得到的病原菌進行形態(tài)特征、致病性及核糖體DNA-ITS序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和平頭炭疽菌（C. truncatum）均能引起貴州火龍果果實炭疽病，但未對病原菌的生物學(xué)特性進行研究。Guo等（2014）對火龍果果實病害進行分析，初步鑒定認為平頭炭疽菌（C. truncatum）能引起云南省火龍果果實炭疽病，并認為該病原菌最適生長溫度為25 ℃。【本研究切入點】大多數(shù)的研究認為膠孢炭疽菌是引起火龍果炭疽病的主要病原菌，而對其他病原菌引起的火龍果炭疽病及其生物學(xué)特性研究的報道較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對海南省火龍果果實炭疽病病原菌進行分離，發(fā)現(xiàn)除膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）外，還有其他種類炭疽菌（Collectotrichum sp.）也能引起炭疽病，因此，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用組織分離、形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子鑒定的方法對所分離的病原菌進行種類鑒定，并初步研究其生物學(xué)特性，以期為火龍果炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

從海南省海口市各超市、水果市場采集發(fā)病火龍果果實；健康火龍果果實購于?？谑心媳彼袌觥?/p>

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株分離及純化 對典型炭疽病癥狀進行描述，并采用組織分離法對病原菌進行分離純化。將所獲得菌株進行初步篩選，剔除膠孢炭疽菌，其余菌株于4 ℃保存待用。

1. 2. 2 菌株致病性測定

1. 2. 2. 1 對火龍果的致病性測定 采用損傷接種法。取28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的菌餅（ф=5 mm，下同）接種于健康火龍果果實上，每個果實接種2點，每處理3個果實，以無菌PDA培養(yǎng)基塊為對照，置于保鮮盒中28 ℃恒溫保濕培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，明確該病原菌對火龍果的致病性。

1. 2. 2. 2 對其他作物的致病性測定 采用損傷接種法。取28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的菌餅接種于健康大豆豆莢和番茄果實上，置于保鮮盒中28 ℃恒溫保濕培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，明確該病原菌對大豆豆莢和番茄的致病性。

1. 2. 3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察菌絲體形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、剛毛及孢子形態(tài)、顏色、大小等特征，同時參考已有文獻（戚佩坤，2000；陸家云，2001）進行病原菌形態(tài)學(xué)鑒定。

1. 2. 4 病原菌rDNA-ITS區(qū)擴增和序列分析

1. 2. 4. 1 病原菌基因組DNA提取及rDNA-ITS區(qū)PCR擴增 用滅菌小藥勺輕輕刮取約100 mg新鮮菌絲于研缽中，用液氮充分研磨成粉狀，采用植物基因組DNA提取試劑盒[購于天根生化科技（北京）有限公司]對病原菌基因組DNA進行提取。參照White等（1990）設(shè)計的真菌rDNA-ITS通用引物（上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對病原菌rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）：1.0 μL病原菌DNA，2.0 μL 10 μmol/L ITS1，2.0 μL 10 μmol/L ITS4，25.0 μL 2×（HS）Taq-Mixture，20.0 μL ddH2O。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1. 2. 4. 2 病原菌rDNA-ITS序列克隆及測序 采用TA Cloning試劑盒（購于Invitrogen公司）將回收純化產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將PCR檢測陽性的產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件與已知的植物病原菌ITS基因進行比對，分析它們之間的生物相似性。

1. 2. 5 病原菌生物學(xué)特性研究

1. 2. 5. 1 不同溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 挑取菌齡一致的菌餅于PDA培養(yǎng)基上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35和40 ℃下倒置培養(yǎng)，每處理3個皿，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，10 d后用10 mL無菌水洗下孢子，采用血細胞計數(shù)板測定各梯度產(chǎn)孢量。重復(fù)3次。

1. 2. 5. 2 不同pH對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 用無菌的0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)滅菌后PDA培養(yǎng)基，制成pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10和11的9種培養(yǎng)基，將菌餅分別接種于不同pH PDA培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)，其余方法同1.2.5.1。

1. 2. 5. 3 不同光照對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，分別在黑暗、12 h光暗交替和連續(xù)光照的條件下，28 ℃倒置培養(yǎng)，其余方法同1.2.5.1。

1. 2. 5. 4 不同碳源對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 參考胡美姣等（2013）的方法并略加修改。以査氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（沈萍和陳向東，2007），分別用等摩爾C量的D-果糖、山梨醇、D-半乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、D-木糖代替蔗糖，以無碳源培養(yǎng)基作對照，其余方法同1.2.5.1。

1. 2. 5. 5 不同氮源對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 參考胡美姣等（2013）方法并略加修改。以査氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（沈萍和陳向東，2007），分別用等摩爾N量的牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、硝酸銨、硝酸鈉、尿素代替硝酸鈉，以無氮源培養(yǎng)基作對照，其余方法同1.2.5.1。

1. 2. 5. 6 致死溫度測定 取菌餅置于含5 mL無菌水的離心管中，分別于50、55、60、65、70和75 ℃恒溫水浴10 min，挑取菌餅接種至PDA培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況。每處理3皿，重復(fù)4次。

1. 3 統(tǒng)計分析

利用SAS 8.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，采用Duncans法進行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病害癥狀

該病危害火龍果果實，引起果實大量腐爛。發(fā)病初期，在果皮及其鱗片上出現(xiàn)污黃色、水漬狀的小斑點，圓形，病斑擴大后，邊緣呈污黃色至黃褐色水漬狀、中央黑色凹陷，其上布滿許多小顆粒，即為分生孢子盤及分生孢子（圖1）。濕潤時，發(fā)病部位長出紅色粘稠物質(zhì)，即為分生孢子堆。

2. 2 致病性測定結(jié)果

該菌可使火龍果果實致病，發(fā)病癥狀與自然發(fā)病時相似，病斑污黃色且呈較規(guī)則圓形，隨后病斑不斷擴大，中間為淡灰色至黑色，分布有黑色小點，即為分生孢子盤及分生孢子（圖2），病健交界更明顯。挑取病部病原物置于顯微鏡下觀察，可見彎曲、單胞的分生孢子。該菌也侵染大豆豆莢、番茄果實，引起嚴重腐爛（圖3）。

2. 3 病原菌形態(tài)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，該菌菌落圓形，邊緣整齊，初期灰白色，絨毛狀，后期為深灰色至墨綠色，菌絲暗灰色，菌落輪紋較清晰，基質(zhì)黑褐色，菌落表面分散許多小顆粒即分生孢子盤及分生孢子，培養(yǎng)后期出現(xiàn)橘紅色孢子堆。菌核不規(guī)則，表面為黑色，內(nèi)部淺褐色，組織緊密；分生孢子盤橢圓形或扁圓形，黑褐色；剛毛黑褐色，頂端色淺，較尖，具有1～3分隔，基部無明顯膨大，大小42.25～209.44 μm。分生孢子梗棒狀。分生孢子無色，鐮刀形，兩頭鈍尖，單胞，有油滴，大小17.14～26.91（21.41）μm×2.43～5.49（3.44）μm。附著胞褐色，近圓形、扁球形、棒形或不規(guī)則，大小為6.9～11.3（8.4）μm×4.5～6.4（5.4）μm。

2. 4 病原菌rDNA-ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

測序結(jié)果表明，供試菌株ITS序列為576 bp（圖5）。在NCBI上BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該菌ITS序列與平頭炭疽菌（登錄號：HQ896482、AF451899）、辣椒炭疽菌（登錄號：JX910365、HQ271465）的同源性均達100%。用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，另外選取10個同源性高低不同的菌株進行多重序列比較，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。該菌與平頭炭疽菌（登錄號：HQ896482、AF451899）和辣椒炭疽菌（登錄號：JX910365、HQ27 1465）具有很近的遺傳關(guān)系（圖6）。因此，通過病原菌的形態(tài)鑒定、rDNA-ITS序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹，以及致病性測定結(jié)果，確定引起海南省火龍果果實炭疽病的另一種病原菌為平頭炭疽菌[C. truncatum（Schw.）Andrus & Moore]，該病原菌在基因庫中的登錄號為：KP731886。

2. 5 病原菌生物學(xué)特性分析

2. 5. 1 溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖7可知，在5～30 ℃內(nèi)，該菌菌絲生長速率隨著溫度升高而增大，在30 ℃時菌絲生長最快，菌落直徑達41.78 mm，極顯著高于其他溫度條件下的菌落直徑（P<0.01，下同）；在35 ℃時，菌絲生長速率下降，40 ℃時不生長；該菌產(chǎn)孢量在15～30 ℃時逐漸升高，30 ℃時的產(chǎn)孢量最大，為15.67×105個/mL，除與35 ℃時產(chǎn)孢量不顯著外（P>0.05，下同），極顯著高于其他溫度條件下的產(chǎn)孢量。本研究還發(fā)現(xiàn)，在5和40 ℃下該菌菌絲不能生長，但當(dāng)溫度恢復(fù)到30 ℃時，5 ℃的菌絲呈現(xiàn)緩慢生長現(xiàn)象，而40 ℃菌絲停止生長；10 ℃時，菌絲雖然生長但不產(chǎn)孢。故該菌適宜生長溫度為20～30 ℃，產(chǎn)孢適宜溫度為25～35 ℃，最適生長和產(chǎn)孢溫度均為30 ℃。

2. 5. 2 pH對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖8可知，該菌在弱酸、弱堿條件下均能夠生長，在pH為3～8時，菌絲生長速率逐漸增快，pH為8時菌落最大，直徑達35.63 mm，極顯著高于其他處理的菌落大小，之后隨著pH升高，菌絲生長速率下降。該菌在pH為3時不產(chǎn)孢，當(dāng)pH為4時產(chǎn)孢量最大，達9.43×105個/mL，極顯著高于其他處理的產(chǎn)孢量，之后隨著pH升高，產(chǎn)孢量下降。故該菌適宜生長pH為4～9，最適pH為8，適宜產(chǎn)孢pH為4～7，最適產(chǎn)孢pH為4。

2. 5. 3 光照對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖9可知，該菌在不同光照條件下均能生長，其中連續(xù)光照和12 h光暗交替條件下的菌落直徑極顯著高于完全黑暗條件下的菌落直徑，且前兩者菌落直徑差異不顯著。完全黑暗有利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為2.05×105個/mL，極顯著高于其他2個處理的產(chǎn)孢量。

2. 5. 4 不同碳源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖10可知，該菌對蔗糖和D-果糖2種碳源的利用率最高，培養(yǎng)5 d后菌落直徑分別達38.07和35.79 mm，極顯著高于其他處理的菌落大?。辉跓o碳源的培養(yǎng)基上菌絲雖然生長較快，但菌絲稀疏，較難觀察；對其他碳源利用高低依次為葡萄糖>D-木糖>可溶性淀粉>D-山梨醇>麥芽糖>D-半乳糖。可溶性淀粉有利于該菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量最大，為12.50×105個/mL，極顯著高于其他處理的產(chǎn)孢量，而葡萄糖和D-木糖不利于該菌產(chǎn)孢。

2. 5. 5 不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖11可知，牛肉膏和蛋白胨為該菌適宜氮源，培養(yǎng)5 d后菌落直徑達37.33和36.04 mm，極顯著高于其他氮源處理的菌落大小；在無氮源的培養(yǎng)上菌絲雖然生長較快，但菌絲稀薄；對其他氮源利用高低依次是硝酸鈉>甘氨酸>L-精氨酸>尿素>L-苯丙氨酸>硝酸銨。硝酸銨雖然不利于菌絲生長，但有利于該菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量可達144.75×105個/mL，極顯著高于其他氮源處理的產(chǎn)孢量，而甘氨酸不利于該菌產(chǎn)孢。

2. 5. 6 致死溫度測定 經(jīng)50和55 ℃處理10 min，該菌菌絲在PDA培養(yǎng)基上仍能再生長，但60～75 ℃處理10 min后菌絲均不再生長，由此認為該菌菌絲的致死溫度為60 ℃處理10 min。

3 討論

本研究分離獲得的菌株的ITS序列與基因庫中C. truncatum（登錄號：HQ896482）、C. capsici（登錄號：JX910365）的同源性均達100%，與Guo等（2014）報道一致。陳吳鍵（2007）研究發(fā)現(xiàn)，C. truncatum與C. capsici的菌落形態(tài)相似，但兩者間存在一些區(qū)別，如C. capsici在培養(yǎng)基中不產(chǎn)生菌核，而C. truncatum產(chǎn)生菌核。本研究在培養(yǎng)后期觀察到菌核。曾大興等（2004）研究認為，C. truncatum和C. capsici是同一個種，而傳統(tǒng)分類系統(tǒng)認為炭疽菌屬的種在一定寄主植物上嚴格?；?。孫志峰等（2008）和樓兵干等（2009）認為引起大豆豆莢炭疽病的病原菌種名用C. truncatum比C. Capsici更貼切。Guo等（2014）和鄭偉等（2014）對引起火龍果果實炭疽病病原菌種名采用平頭炭疽菌（C. truncatum）而不是辣椒炭疽菌（C. capsici）。本研究交互接種結(jié)果顯示，從火龍果果實上分離的C. truncatum能侵染大豆豆莢和番茄果實，且發(fā)病快。此外，Von Arx（1970）認為炭疽菌的各形態(tài)單位在分類中的權(quán)重并不一樣，分生孢子和附著胞的形態(tài)和大小是鑒定分類中的主要形態(tài)特征，但分生孢子盤、剛毛、菌落、菌核也可作為病原菌鑒定的輔助依據(jù)。因此，本研究綜合考慮分生孢子、菌核與寄主特征、rDNA-ITS序列、系統(tǒng)發(fā)育樹分析及種名應(yīng)用的穩(wěn)定性，認為引起海南省火龍果果實炭疽病的另一種病原菌是C. truncatum。該菌對其他作物的致病性測定結(jié)果表明，其還可侵染大豆豆莢、番茄果實等，與已報道C. truncatum引起大豆豆莢炭疽?。潜傻?，2009；肖杰文等，2011）、番茄炭疽?。―iao et al.，2014）一致。此外，C. truncatum也能引起豇豆莖炭疽病（徐麗慧等，2014）、棉花炭疽?。钣崖?lián)等，2014），但對該菌株的寄主范圍及專化型仍需進一步研究。

Guo等（2014）和鄭偉等（2014）分別對引起云南省、貴州省火龍果果實炭疽病病原進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其病原菌為平頭炭疽菌（C. truncatum），但均未深入研究該菌生物學(xué)特性。本研究發(fā)現(xiàn)，火龍果平頭炭疽菌菌絲生長的適宜溫度為20～30 ℃，產(chǎn)孢適宜溫度為25～35 ℃，最適生長和產(chǎn)孢溫度均為30 ℃。Guo等（2014）認為該菌生長的最適溫度為25 ℃，本研究結(jié)果較其略高，究其原因可能是菌株來源的地區(qū)間差異所造成。該菌菌絲適宜生長pH為4～9，最適生長pH為8，產(chǎn)孢適宜pH為4～7，最適產(chǎn)孢pH為4，與孫志峰等（2008）對大豆C. truncatum研究結(jié)果略有不同，其認為C. truncatum適宜的生長pH為4～7，可能是由于C. truncatum在進化過程中受寄主或環(huán)境條件的選擇作用而產(chǎn)生變化。

該菌在以蔗糖和D-果糖作為碳源和以牛肉膏和蛋白胨作為氮源時菌絲生長最快，在無碳氮源時菌絲生長緩慢，菌絲稀疏，不易觀察，說明火龍果平頭炭疽菌的生長需要碳氮源。此外，可溶性淀粉為碳源、硝酸銨為氮源、酸性和黑暗條件下，均能促進該病原菌產(chǎn)孢。因此，在C. truncatum防治中要盡量避免其生長和產(chǎn)孢的有利條件。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，引起海南省火龍果果實炭疽病的另一種病菌原是平頭炭疽菌[C. truncatum（Schw.）Andrus & Moore]，該菌不僅侵染火龍果果實，還能侵染大豆豆莢和番茄果實。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）