魏繼海 趙金良 Thammaratsuntorn Jeerawat 羅明坤 趙永華

摘要：【目的】篩選對雌性尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）性腺發(fā)育影響最明顯的催產(chǎn)激素組合及最佳劑量，為開展尼羅羅非魚人工催產(chǎn)與繁殖提供參考依據(jù)。【方法】設(shè)計5組標(biāo)準(zhǔn)劑量的催產(chǎn)激素組合，分別為：①地歐酮（DOM） 6 mg/kg+促黃體素釋放激素A2（LRH-A2）10 μg/kg；②DOM 6 mg/kg+促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-A4）8 μg/kg；③DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+絨毛膜促性腺激素（HCG）2000 U/kg；④DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+ HCG 2000 U/kg+鯉魚腦垂體（PG）6 mg/kg；⑤DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+PG 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg，并選擇組合③進(jìn)行1.0、1.5和2.0倍的激素劑量篩選試驗，然后檢測注射后0、24、36、48和72 h雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素[促性腺激素釋放激素（GnRH）、促性腺激素（GTH）、雌二醇（E2）和孕酮（P）]的含量變化?！窘Y(jié)果】雌性尼羅羅非魚血清GnRH、E2含量于注射后24 h達(dá)最大值，GTH、P含量則在注射后36 h達(dá)最大值；其中，組合③、④和⑤引起的類固醇激素含量升高變化最明顯，顯著高于組合①和②（P<0.05，下同），但組合③、④、⑤間差異不顯著（P>0.05，下同）。1.5倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組引起的血清類固醇激素含量變化最明顯，顯著高于1.0和2.0倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組，而1.0與2.0倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組間無顯著差異?！窘Y(jié)論】進(jìn)行尼羅羅非魚人工繁殖時，使用多種催產(chǎn)激素組合的效果優(yōu)于單一催產(chǎn)激素，且催產(chǎn)劑量一般應(yīng)高于常規(guī)魚類。

關(guān)鍵詞： 尼羅羅非魚；類固醇激素；催產(chǎn)激素；組合；劑量

中圖分類號： S965.125 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）01-0128-06

0 引言

【研究意義】羅非魚是世界性的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖對象之一，具有生長快、繁殖力強(qiáng)、性成熟早（4～5個月即開始性成熟）、產(chǎn)卵周期短（隔25～35 d繁殖一次）等優(yōu)點（藍(lán)厚珍和趙福江，1988）。在自然環(huán)境下羅非魚易繁殖，但人工繁殖卻非常困難，主要是因為羅非魚個體間性腺發(fā)育非同步性，卵子成熟過程短（劉筠等，1983），難以獲得大量成熟卵子進(jìn)行受精。而在羅非魚的遺傳育種研究中，如雌核發(fā)育、多倍體、遠(yuǎn)緣雜交，通常需要大量的成熟卵子（Chourrout and Itskovich，1983；Mair et al.，1987；Don and Avtalion，1988），因此，成熟卵子的獲得已成為羅非魚遺傳育種工作的瓶頸問題。【前人研究進(jìn)展】目前，國內(nèi)外關(guān)于使用催產(chǎn)激素誘導(dǎo)羅非魚性腺發(fā)育的研究報道相對較少。李建林和劉麗平（2006）通過對奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）進(jìn)行人工繁育，發(fā)現(xiàn)以地歐酮（DOM）4 mg/kg+促黃體素釋放激素A2（LRH-A2）6 μg/kg對雌魚的催產(chǎn)效果最佳，催產(chǎn)率為62.5%。李瑞偉等（2011）對吉富羅非魚進(jìn)行人工催產(chǎn)試驗，認(rèn)為絨毛膜促性腺激素（HCG）3000 U/kg+LRH-A2 15 μg/kg+DOM 9 mg/kg的催產(chǎn)效果最佳，催產(chǎn)率在66.0%左右。Fernandes等（2013）比較了幾種單一催產(chǎn)激素（PE、HCG和GnRH）促進(jìn)尼羅羅非魚（O. niloticus）卵母細(xì)胞成熟與排卵的效果，發(fā)現(xiàn)以HCG誘導(dǎo)效果最佳，建議使用劑量為1000～5000 U/kg。魏繼海等（2015）探討了不同劑量催產(chǎn)激素對尼羅羅非魚卵巢成熟過程中卵子形態(tài)、卵黃蛋白原含量及Vtg mRNA表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，以1.5倍劑量組對尼羅羅非魚卵巢成熟發(fā)育影響變化最明顯，激素注射后96 h，尼羅羅非魚卵子成熟度最佳，可用于進(jìn)一步的人工繁殖試驗?！颈狙芯壳腥朦c】通過注射或埋植外源激素，可在“腦—垂體—性腺”軸的某種或多種水平上外源性調(diào)節(jié)魚體的內(nèi)分泌活動，刺激內(nèi)源激素的產(chǎn)生與分泌，誘導(dǎo)性腺成熟并排出精卵，但目前針對尼羅羅非魚人工催產(chǎn)排卵的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究人工合成激素對雌性尼羅羅非魚血清中各類固醇激素的影響變化，篩選出對雌性尼羅羅非魚性腺發(fā)育影響最明顯的催產(chǎn)激素組合及最佳劑量，為開展尼羅羅非魚人工催產(chǎn)與繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用雌性尼羅羅非魚來自上海海洋大學(xué)羅非魚種質(zhì)資源試驗站，體重450～650 g，均為1齡親魚。2014年7月28日通過擠卵觀察法挑選性腺發(fā)育較好的雌魚180余尾，然后轉(zhuǎn)入室內(nèi)水族箱（120 cm×60 cm×70 cm）中暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間水溫25～27 ℃，pH 6.94～ 7.32，24 h不間斷充氧。8月12～18日開展不同催產(chǎn)激素組合注射試驗；8月24～30日開展不同劑量注射試驗。促黃體素釋放激素A2（LRH-A2）、絨毛膜促性腺激素（HCG）、地歐酮（DOM）和鯉魚腦垂體（PG）購自寧波第二激素廠，促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-A4）購自四川省精科生化制品有限責(zé)任公司。

1. 2 激素注射

催產(chǎn)激素組合共設(shè)5組：①DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg；②DOM 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg；③DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg；④DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+ PG 6 mg/kg；⑤DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+PG 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg。注射相同劑量生理鹽水作為空白對照組，每組注射5尾，3次重復(fù)。根據(jù)不同激素組合的試驗結(jié)果，選用最佳的激素組合，其注射劑量分別為標(biāo)配劑量1.0、1.5和2.0倍，每組注射5尾，空白對照組注射相同劑量的生理鹽水。

1. 3 樣品采集

注射催產(chǎn)激素后，分別于0、24、36、48和72 h從羅非魚尾柄處抽取血液1～2 mL，4 ℃下靜置6～8 h。血液完全凝集后3500 r/min離心20 min，吸出上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 血清中類固醇激素含量測定

血清促性腺激素釋放激素（GnRH）、促性腺激素（GTH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）含量測定均使用上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供的ELISA試劑盒，按試劑盒說明進(jìn)行測定（陳松林等，1995）。在BioTek Synergy酶標(biāo)儀450 nm波長下測定其吸光值（OD），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中的類固醇激素含量。

1. 5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以Excel 2013軟件進(jìn)行整理，使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行差異顯著性分析，利用單因素方差分析法（ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并采用Duncans法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同催產(chǎn)激素組合對雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素含量的影響

經(jīng)不同催產(chǎn)激素組合催產(chǎn)后，雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素水平變化情況詳見表1～4。注射后24 h，各激素注射組的雌性尼羅羅非魚血清GnRH、GTH、E2、P含量均呈顯著上升趨勢（P<0.05，下同），其中，GnRH、E2含量于注射后24 h達(dá)最大值（表1和表3），GTH、P含量則在注射后36 h達(dá)最大值（表2和表4）；注射后48 h，各激素注射組的雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素含量均顯著下降；至注射后72 h，各激素注射組與對照組的雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素水平基本一致?？梢?，注射不同催產(chǎn)激素后，均能引起雌性尼羅羅非魚產(chǎn)生不同程度的催產(chǎn)效應(yīng)。

通過對比不同催產(chǎn)激素注射組，發(fā)現(xiàn)注射后24 h，組合③、④和⑤的雌性尼羅羅非魚血清GnRH、E2含量變化最明顯，顯著高于組合①和②（表1和表3）。除去5個激素組合中均含有DOM外，組合①中只含有LRH-A2、組合②只含有GnRH-A4，而組合③、④和⑤中含有兩種及兩種以上催產(chǎn)激素，因此推測，多種催產(chǎn)激素組合的催產(chǎn)效果比單一催產(chǎn)激素作用的效果更明顯。組合③、④、⑤間差異不顯著（P>0.05，下同），但以組合⑤的雌性尼羅羅非魚血清GnRH、E2含量最高，進(jìn)一步驗證多種激素組合的催產(chǎn)效果更優(yōu)。注射后36 h，組合③、④和⑤的雌性尼羅羅非魚血清GTH、P含量顯著高于組合①和②，組合①與組合②間差異顯著，組合③、④、⑤間差異不顯著，但以組合⑤的血清GTH、P含量最高（表2和表4）。在血清GTH、P含量方面，多種催產(chǎn)激素組合（組合③、④和⑤）的催產(chǎn)效果也優(yōu)于單一激素的催產(chǎn)效果（組合①和②），其變化規(guī)律與血清GnRH、E2含量變化一致。

2. 2 不同催產(chǎn)激素劑量對雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素含量的影響

從經(jīng)濟(jì)實用角度考慮，本研究選擇組合③（DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg）進(jìn)行催產(chǎn)激素劑量篩選試驗。由圖1可以看出，注射不同劑量催產(chǎn)激素后，雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素含量的變化趨勢與不同催產(chǎn)激素組合注射后的變化趨勢一致，即血清GnRH、E2含量在注射后24 h達(dá)最大值，而血清GTH、P含量在注射后36 h達(dá)最大值。不同劑量催產(chǎn)激素注射組的雌性尼羅羅非魚血清GnRH、E2、GTH、P含量均顯著高于對照組；不同劑量催產(chǎn)激素注射組間比較，其結(jié)果顯示，1.5倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組的血清類固醇激素含量顯著高于1.0和2.0倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組，但1.0與2.0倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組間無顯著差異。說明適量增大催產(chǎn)劑量可提高催產(chǎn)效果。

3 討論

GnRH是由下丘腦分泌細(xì)胞合成與分泌，通過刺激垂體前葉釋放GTH，以調(diào)節(jié)腦垂體分泌活動及性腺發(fā)育的主要激素之一（Amono et al.，1997）。GTH在許多硬骨魚類中存在兩種類型：GTH-I和GTH-Ⅱ。其中，GTH-I具有促進(jìn)卵黃蛋白原進(jìn)入卵母細(xì)胞的作用，GTH-Ⅱ則能刺激性激素生成、配子發(fā)生與成熟、排卵（Idler et al.，1975；Swanson et al.，1991）。E2是由卵巢卵泡細(xì)胞所分泌，能夠促進(jìn)卵巢發(fā)育、副性征出現(xiàn)、排卵后卵巢的再發(fā)育及促使肝臟合成卵黃蛋白原（Holland et al.，2000）；而P分泌水平與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)，首先被轉(zhuǎn)化為17α-羥孕酮（17α-OHP），再被轉(zhuǎn)化為17α，20β-雙羥孕酮（17α，20β-DHP），而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞最后成熟及排卵（Comeau et al.，2001）。本研究中，以不同催產(chǎn)激素組合注射雌性尼羅羅非魚后，均可引起其血清類固醇激素（GnRH、GTH、E2和P）含量明顯升高，其中，GnRH、E2含量在注射后24 h達(dá)最大值，隨著時間推移，GnRH、E2含量逐漸下降，至注射后72 h接近正常水平；GTH、P含量在注射后24 h顯著上升，36 h達(dá)最大值，之后也呈逐漸下降趨勢。雌性尼羅羅非魚血清中不同類固醇激素的應(yīng)答時間存在先后順序差異（GTH晚于GnRH，P晚于E2），可能是垂體中GTH的合成與分泌活動直接受下丘腦GnRH分泌水平調(diào)節(jié)，由于P的主要生理作用是誘導(dǎo)卵巢最后成熟及排卵，其分泌一般晚于雌激素分泌是受內(nèi)分泌系統(tǒng)自身調(diào)控，與團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）（姜仁良等，1986）、大鱗副泥鰍（Paramisgumus dabryanus）（宋艷等，2007）、條斑星鰈（Verasper moseri）（倪娜等，2011）等產(chǎn)卵前E2、P表達(dá)最高峰時期順序基本一致。

不同催產(chǎn)激素組合對血清類固醇激素含量變化的影響不盡相同。本研究中，組合③、④和⑤的影響作用顯著高于組合①和②。組合③、④和⑤中均含有HCG、LRH-A2和DOM，推測HCG（或HCG+LRH-A2）對雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素含量影響作用更顯著，與Fernandes等（2013）的研究結(jié)果一致，即單一激素條件下，HCG的誘導(dǎo)效應(yīng)高于LRH-A2和GnRH-A4。LRH-A2主要作用于腦垂體，引起促卵泡素和促黃體素生成，促使卵巢成熟及排卵（龍進(jìn)等，2004）；而HCG具有促使性腺成熟發(fā)育、性激素產(chǎn)生、促進(jìn)排卵、促黃體產(chǎn)生等生理作用（左永松等，2013）。DOM為多巴胺（DA）拮抗物，DA在垂體水平可阻抑GnRH和GTH的合成與釋放，注射DOM可在垂體水平上消除DA的抑制作用，間接促進(jìn)類固醇類激素的合成與分泌。比較組合③、④和⑤的注射效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)繼續(xù)增加激素種類如PG和GnRH-A4，雖然對雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素含量上升仍有一定的促進(jìn)作用，但不同催產(chǎn)激素組合間的效應(yīng)差異不顯著，其原因或許與多種激素組合的效應(yīng)間存在一定拮抗或抑制作用有關(guān)。從經(jīng)濟(jì)實用角度考慮，組合③（DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+ HCG 2000 U/kg）是引起雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素含量變化作用最佳的激素組合，與吉富品系尼羅羅非魚人工催產(chǎn)中的激素組合（李瑞偉等，2011）基本一致。

不同劑量催產(chǎn)激素的催產(chǎn)效果也不同，劑量過低其催產(chǎn)效果不明顯，劑量過高則可能抑制催產(chǎn)效果甚至引起親魚死亡（宋艷等，2007）。激素劑量效應(yīng)可能是通過受體效應(yīng)、信號通路及負(fù)反饋調(diào)節(jié)等共同作用實現(xiàn)。本研究中，1.5倍劑量組的雌性尼羅羅非魚血清類固醇激素含量變化顯著高于1.0和2.0倍劑量組，2.0倍劑量組與1.0倍劑量組間無顯著差異。這可能是2.0倍劑量組濃度過高，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)途徑，在一定程度上抑制了“腦—垂體—性腺”軸的分泌活動，而未能引起血清類固醇激素含量明顯上升。因此，確定1.5倍劑量組（DOM 9 mg/kg+LRH-A2 15 μg/kg+HCG 3000 U/kg）為雌性尼羅羅非魚的最佳催產(chǎn)激素誘導(dǎo)水平，生產(chǎn)上可推廣應(yīng)用。此外，雌性尼羅羅非魚性腺發(fā)育屬于非同步型，催產(chǎn)前需通過人工擠卵方法判斷親魚的成熟度。經(jīng)實踐證實，尼羅羅非魚人工繁殖的最佳時機(jī)宜選擇在越冬后第一次產(chǎn)卵前，此時性腺發(fā)育相對整齊，挑選獲得成熟度好的親魚機(jī)率較大。

4 結(jié)論

進(jìn)行尼羅羅非魚人工繁殖時，使用多種催產(chǎn)激素組合的效果優(yōu)于單一催產(chǎn)激素，且催產(chǎn)劑量一般應(yīng)高于常規(guī)魚類。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）