曹慧慧 孫文超 鄭敏 韋顯凱 蘇姣秀 蒙振畝 黃寶學 劉棋

摘要：【目的】解析鵝圓環(huán)病毒（Goose Circovirus，GoCV）廣西流行毒株的全基因組序列及其遺傳進化地位，掌握廣西GoCV的流行情況，為今后更有效防控GoCV提供理論依據(jù)。【方法】分3段對陽性組織樣品中的GoCV全基因組進行PCR擴增、克隆和測序，并對拼接得到的GoCV廣西流行毒株全基因組進行核苷酸組成、基因組結(jié)構(gòu)及遺傳變異分析?！窘Y(jié)果】GoCV廣西流行毒株（GXTD254）全基因組長度為1822 nt，編碼4個主要開放閱讀框：ORF V1（Rep蛋白，293個氨基酸）、ORF V2（37個氨基酸）、ORF C1（Cap蛋白，250個氨基酸）和ORF C2（99個氨基酸），且Rep蛋白較Cap蛋白相對保守。遺傳進化分析結(jié)果表明，GXTD254毒株與4株浙江永康分離毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、1株浙江象山分離毒株（ZJxs1）的遺傳距離最接近，同屬于一個遺傳分支，但與我國臺灣的大多數(shù)分離毒株（TW1021024G、TWGB21-9、TW6、TW9、TW8和TW1020111GB）及另外2株浙江象山分離毒株（ZJxs3和ZJxs5）的遺傳距離較遠。【結(jié)論】目前我國流行的GoCV存在多個分支，廣西流行毒株與部分浙江分離毒株在親緣關(guān)系上比較接近。

關(guān)鍵詞： 鵝圓環(huán)病毒；全基因組；序列分析；Rep蛋白；Cap蛋白

中圖分類號： S858.33 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）01-0122-06

0 引言

【研究意義】鵝圓環(huán)病毒（Goose Circovirus，GoCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）成員，是無囊膜的二十面體病毒粒子，其直徑約20 nm，為目前已知的最小鵝源病毒（竺春等，2007）。與豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV）和鴨圓環(huán)病毒（Duck Circovirus，DuCV）等同屬成員相似，GoCV也是一種潛在的免疫抑制病毒，主要侵害宿主的淋巴組織，導(dǎo)致宿主免疫抑制，生長遲緩，且增加繼發(fā)感染的可能性，給鵝養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失（Chen et al.，2003）。因此，加強GoCV的相關(guān)研究對確保鵝養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】GoCV最早于1999年由德國學者從患病鵝的病變組織中分離獲得（Soike et al.，2004），2001年Todd等首次克隆并測定了GoCV的全基因組序列。2003年，我國臺灣學者Chen等對GoCV臺灣分離毒株的全基因組進行擴增測序及同源性分析；余旭平等（2005）從因禽流感死亡的鵝體內(nèi)檢出GoCV，并對該流行毒株的基因組結(jié)構(gòu)及流行病學情況進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)浙江永康株GoCV_yk01全長1821 bp，具有與病毒復(fù)制相關(guān)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和Rep蛋白保守基序等圓環(huán)病毒共有的特征，與德國、我國臺灣的流行毒株在全基因組水平有91%～93%的同源性，在Rep蛋白和外殼蛋白的氨基酸水平有94%～97%的同源性。此后，Scott等（2006）將間接免疫熒光檢測方法應(yīng)用于GoCV衣殼蛋白抗體檢測；田敬等（2010）建立了針對GoCV的實時熒光定量PCR檢測方法；徐雅萍等（2012）成功構(gòu)建了GoCV全長基因組頭尾串聯(lián)二聚體感染性克隆，且能通過轉(zhuǎn)染鵝體內(nèi)環(huán)化增殖出帶標記的GoCV克隆。【本研究切入點】目前，國內(nèi)有關(guān)GoCV的研究相對較少，尤其是廣西，針對該病毒流行病學和遺傳變異的研究尚處于空白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】依據(jù)已發(fā)表的GoCV序列設(shè)計3對引物，對采自廣西百色市的鵝組織樣品進行GoCV檢測，通過套疊PCR和反向PCR擴增獲得全長基因組序列，旨在解析GoCV廣西流行毒株的全基因組序列及其遺傳進化地位，掌握廣西GoCV的流行情況，為今后更有效防控GoCV提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

從廣西百色市活禽市場采集49份鵝組織樣品，包括肺臟、脾臟、肝臟、心臟、腎臟、法氏囊等器官組織，-80 ℃保存?zhèn)溆?。MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司； DH5α感受態(tài)細胞、TIANquick Midi Purification Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 引物設(shè)計及基因組全長擴增

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的GoCV全基因組序列，合成3對擴增產(chǎn)物首尾重疊的引物（表1）用于GoCV全基因組擴增，所有引物均由英濰捷基貿(mào)易（上海）有限公司合成。

1. 3 病毒基因組DNA提取

取少量樣品組織充分研磨，以無菌PBS（pH 7.4）按1∶5的比例進行勻漿稀釋，反復(fù)凍融3次后8000 r/min離心10 min，取上清液備用。采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0按說明進行病毒基因組DNA提取。

1. 4 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2×Ex Taq Buffer 12.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1.0 μL，基因組DNA模板5.0 μL，以ddH2O補足至25.0 μL。先用引物對F1-22/R543進行擴增，陽性樣品再以剩余部分基因組的引物對F505/R1261和F1130/R1821分別進行擴增。

1. 5 PCR產(chǎn)物純化與克隆

切膠回收目的片段，以TIANquick Midi Purification Kit進行回收純化，目的基因與pMD18-T載體連接（16 ℃）過夜，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，然后取轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于含有氨芐抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落培養(yǎng)12 h后少量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定陽性的質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司進行測序。

1. 6 全基因序列分析

以DNASTAR的Seqman進行序列拼接得到GoCV全長基因組序列，利用NCBI BLAST軟件分析測序結(jié)果，并與國內(nèi)外主要的GoCV分離參考毒株（表2）進行核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸比對分析，并構(gòu)建遺傳進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 GoCV全長基因組PCR擴增結(jié)果

從49份鵝組織樣品中僅檢出1份陽性樣品，檢出率為2.04%，并將該毒株命名為GXTD254。由圖1可以看出，所設(shè)計的3對引物均能從陽性樣品中擴增獲得對應(yīng)的目的片段（圖1），且片段大小與預(yù)期結(jié)果相符合。

2. 2 GoCV測序結(jié)果分析

測序結(jié)果表明，GXTD254毒株的全基因組長度為1822 nt，GenBank登錄號KT207809。該基因組包含4個主要的開放閱讀框：ORF V1（Rep蛋白，293個氨基酸）、ORF V2（37個氨基酸）、ORF C1（Cap蛋白，250個氨基酸）及ORF C2（99個氨基酸）。其中，V1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白，C1編碼外殼蛋白。與其他GoCV毒株一樣，GXTD254毒株在V1和C1的5'端之間存在一個保守的TATTATTAC莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖2中下劃線部分），而其他不同代表毒株莖環(huán)結(jié)構(gòu)頂部保守序列的第1和第3位堿基略有差異。莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩側(cè)各有一個6堿基正向重復(fù)的GGCGCC序列，而與Rep蛋白基因間存在兩個連續(xù)的正向重復(fù)七堿基序列GTACTCC（圖2方框部分）；七堿基正向重復(fù)序列與Rep蛋白間為一個高變異區(qū)域（圖2黑底部分）。鑒于各GoCV毒株間該區(qū)域高度變異，推測其與病毒自身復(fù)制的相關(guān)性不明顯，但又位于與病毒復(fù)制相關(guān)Rep蛋白起始密碼子的上游區(qū)域，也有可能只是影響Rep蛋白的表達（竺春等，2007）。

2. 3 GoCV各基因片段同源性分析

經(jīng)全基因組序列同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)GXTD254毒株與浙江永康分離毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、浙江象山分離毒株（ZJxs1）的核苷酸同源性較高，均在97.0%以上?；贑ap蛋白氨基酸序列的同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)GXTD254毒株與浙江永康分離毒株（ZJyk2和ZJyk3）的同源性最高（94.8%），與其他GoCV毒株的差異較明顯（表3），說明Cap蛋白變異較大；而基于Rep蛋白氨基酸序列的同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)GXTD254毒株與浙江永康分離毒株（ZJyk1、ZJyk2和ZJyk3）、浙江象山分離毒株（ZJxs1）的氨基酸同源性較高，均在98.0%以上，與其他地區(qū)分離毒株的氨基酸同源性也在96.0%以上（表4），說明Rep蛋白較Cap蛋白相對更保守。

2. 4 GoCV基因組遺傳進化樹分析

基于GoCV全基因組序列，用MEGA 6.0軟件對GXTD254毒株、其他GoCV參考毒株及兩株廣西分離的DuCV毒株進行遺傳進化分析，并繪制遺傳進化樹（圖3），結(jié)果顯示，GXTD254毒株與4株浙江永康分離毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、1株浙江象山分離毒株（ZJxs1）的遺傳距離最接近，同屬于一個遺傳分支，再與Germany2001、Germany2008、TW1、TWGB27-20、ZJxs2、ZJxs4等毒株聚為一個大分支；與兩株廣西分離的DuCV毒株遺傳距離最遠。

3 討論

隨著我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，危害水禽的疾病也越來越多，且日趨復(fù)雜，控制難度不斷加大，已成為嚴重制約水禽規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)的難題，究其原因可能與水禽群中廣泛存在的免疫抑制性疾病相關(guān)（蔡寶祥，2001；余旭平等，2005）。圓環(huán)病毒通常潛伏感染而不引起動物發(fā)病，一般侵害宿主體內(nèi)增殖速度較快的細胞，尤其是淋巴細胞，造成動物生長發(fā)育障礙、免疫力下降，易遭受其他疫病的并發(fā)或繼發(fā)感染（萬春和等，2010）。Soike等（2004）首先報道在德國一家大型養(yǎng)鵝場發(fā)生一種生長發(fā)育障礙和死亡率很高的圓環(huán)病毒感染，并引起機體免疫抑制而繼發(fā)細菌感染；病鵝主要表現(xiàn)為發(fā)育不良、體重下降、羽毛凌亂等，組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)法氏囊、脾臟和胸腺的淋巴細胞減少，其中以法氏囊病變最明顯。此后，英國、我國臺灣、匈牙利等地也相繼報道了該病毒的存在，從而引起各國的廣泛重視。2005年，余旭平等從浙江永康某鵝場感染禽流感的病死鵝中檢測到GoCV的存在，懷疑該病毒能引起其他病原的并發(fā)或繼發(fā)感染，協(xié)助水禽流感的暴發(fā)流行。2007年，楊曉偉等在重慶榮昌某鵝場的病死鵝中也檢測到GoCV。目前，廣西對GoCV的研究尚處于空白，缺乏病毒流行病學和遺傳變異方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

由于GoCV目前尚無法進行體外培養(yǎng)，其研究主要在于核酸擴增及序列測定。本研究采用PCR首次從廣西本地鵝組織中檢出GoCV，檢出率為2.04%。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，GXTD254毒株全基因組序列包含4個主要的開放閱讀框，其中ORF V1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，ORF C1編碼病毒的衣殼蛋白。與參考毒株進行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)Rep蛋白氨基酸序列相對保守，各毒株間的氨基酸同源性均在96.0%以上；但不同毒株間Cap蛋白氨基酸序列差異較明顯，同源性最低的只有69.7%，可能與病毒需要適應(yīng)宿主免疫系統(tǒng)有關(guān)。對病毒Rep和Cap基因5'端間隔區(qū)序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)GXTD254毒株與其他GoCV毒株一樣，存在一個保守的TATTATTAC莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但圓環(huán)病毒其他不同代表株莖環(huán)結(jié)構(gòu)頂部保守序列的第1和第3位堿基略有差異，與Phenix等（2001）的研究結(jié)果一致。此外，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)與Rep蛋白基因間存在兩個連續(xù)的正向重復(fù)七堿基序列（GTACTCC），在莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩側(cè)還各有一個正向重復(fù)的GGCGCC序列。莖環(huán)結(jié)構(gòu)周圍的這些重復(fù)序列有可能與病毒復(fù)制有關(guān)，是圓環(huán)病毒Rep蛋白的結(jié)合位點（Mankertz et al.，1997，2000；Niagro et al.，1998；Todd et al.，2001）。

由構(gòu)建的遺傳進化樹可知，GXTD254毒株與4株浙江永康分離毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、1株浙江象山分離毒株（ZJxs1）的遺傳距離最接近，同屬于一個遺傳分支，但與我國臺灣的大多數(shù)分離毒株（TW1021024G、TWGB21-9、TW6、TW9、TW8和TW10 20111GB）及另外2株浙江象山分離毒株（ZJxs3和ZJxs5）的遺傳距離較遠，說明目前我國流行的GoCV存在多個分支，進而給GoCV防控工作提出了新難度。

4 結(jié)論

目前我國流行的GoCV存在多個分支，廣西流行毒株與部分浙江分離毒株在親緣關(guān)系上比較接近，因此可借鑒其成功的GoCV防控經(jīng)驗。

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（責任編輯 蘭宗寶）