趙滿+李麗芳+王友竹+Elena+N.+Elpidina+朱家穎

摘要：翅芽生長(zhǎng)因子（imaginal disc growth factor，IDGF）是一類調(diào)節(jié)昆蟲發(fā)育和生長(zhǎng)的因子。利用RACE克隆技術(shù)，克隆獲得黃粉甲（Tenebrio molitor） IDGF基因，其cDNA序列長(zhǎng)1 465 bp，開放閱讀框?yàn)? 296 bp，可編碼431個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)理論分子量為48.25 ku，等電點(diǎn)為7.63。氨基酸序列同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，黃粉甲IDGF與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）和蔗根非耳象（Diaprepes abbreviatus）的IDGF相似性分別為89%、71%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，黃粉甲IDGF與赤擬谷盜IDGF進(jìn)化關(guān)系最近。熒光定量PCR分析表明，在不同發(fā)育階段，IDGF基因在幼蟲1齡和2齡中的表達(dá)量明顯高于其他發(fā)育階段。在蛹期不同組織中，IDGF基因在脂肪體中的表達(dá)量最高。被管氏腫腿蜂（Scleroderma guani）寄生后，IDGF基因的轉(zhuǎn)錄水平未受影響，表明寄生不能調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

關(guān)鍵詞：翅芽生長(zhǎng)因子；基因克?。稽S粉甲；序列分析；管氏腫腿蜂

中圖分類號(hào)： S433.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0095-04

翅芽生長(zhǎng)因子（imaginal disc growth factor，IDGF）是一種可溶性多肽生長(zhǎng)因子，因在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）翅芽C1.8+細(xì)胞中鑒定具有促進(jìn)翅芽細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)而得名[1-2]。最初，科學(xué)家們?cè)诤诟构壷型ㄟ^同源性搜索和遺傳分析發(fā)現(xiàn)存在一些類生長(zhǎng)因子，如Spitz和Gurken的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）[2-6]。但是，這些基因不具有生長(zhǎng)因子所具備的促進(jìn)有絲分裂活性，而僅是這些基因編碼的分泌蛋白異常表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞增生并抑制生長(zhǎng)[7-9]。然而，經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)認(rèn)為，IDGF可能是作為胰島素或類胰島素的一個(gè)輔助因子而發(fā)揮生理功能[10-11]。目前，遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，IDGF參與調(diào)節(jié)果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育，在果蠅的胚胎卵黃細(xì)胞、胚胎和幼蟲的脂肪體中顯著表達(dá)，其蛋白分泌到血淋巴并運(yùn)輸?shù)桨袠?biāo)組織而發(fā)揮生理功能[2]。本研究從黃粉甲（Tenebrio molitor）蛹中克隆得到IDGF基因的cDNA序列，并采用熒光定量PCR方法研究該基因在黃粉甲不同發(fā)育階段、不同組織以及被管氏腫腿蜂（Scleroderma guani）寄生后的表達(dá)情況，為今后深入研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx參照Z(yǔ)hu等的方法[12]進(jìn)行飼養(yǎng)。黃粉甲幼蟲用飼料和潔凈白菜葉室溫自然光條件飼養(yǎng)。利用黃粉甲蛹在人工氣候箱[（25 ± 1） ℃，相對(duì)濕度75%]中繁育管氏腫腿蜂。管氏腫腿蜂成蜂用蘸透20%蜂蜜水的脫脂棉球提供營(yíng)養(yǎng)。

1.2 IDGF的克隆及分析

利用Trizol試劑法（Invitrogen）提取黃粉甲蛹總RNA。采用分光光度法測(cè)定總RNA含量，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。以提取的總RNA為模板，用SMARTM RACE cDNA amplification kit （Clontech）合成cDNA模板。依據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)黃粉甲cDNA文庫(kù)測(cè)序獲得IDGF片段序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)5′ RACE（5′-CGAACGCCAGACGATGTTCGACAGAT-3′）和3′RACE（5′-CGCACCCAACAACAAG CTGAT-3′）特異性引物。參照RACE試劑盒說明書，PCR擴(kuò)增獲得IDGF基因的3′端和5′端序列。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的條帶并純化后送至上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

利用Genetyx軟件將翅芽生長(zhǎng)因子IDGF基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，利用SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)構(gòu)域采用MotifScan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用ClustalX 1.83和MEGA 5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹[13-14]。

1.3 熒光定量PCR

參照Z(yǔ)hu等的方法[15]收集黃粉甲不同發(fā)育階段（幼蟲1～3齡、蛹、成蟲）、蛹不同組織（表皮、脂肪體、血細(xì)胞）及被管氏腫腿蜂寄生和未寄生（6、12、24、48 h）蛹樣品進(jìn)行總RNA提取，提取的總RNA使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。根據(jù)本次克隆獲得的黃粉甲IDGF cDNA序列，設(shè)計(jì)熒光定量正向引物（5′-CCCAACGTTAACAGCTCT-3′）和反向引物（5′-CCTGTCGATTAATTCGTA-3′），以18 S RNA基因（5′-TTTCAAATGTCTGCCTTATC-3′和5′-TGTGGTAGCCGTTTCTCA-3′）作為內(nèi)參使用Rotor Gene-Q熒光定量PCR儀檢測(cè)IDGF基因在黃粉甲不同發(fā)育階段、不同組織以及寄生與未寄生后的表達(dá)情況，每個(gè)處理重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCT法[16]，數(shù)據(jù)顯著性差異分析采用SPSS軟件進(jìn)行分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 IDGF基因的克隆及序列分析

克隆獲得的黃粉甲IDGF基因cDNA長(zhǎng)為1 465 bp，開放閱讀框框長(zhǎng)為1 296 bp，該基因可編碼431個(gè)氨基酸，5′端非編碼區(qū)50 bp，3′端非編碼區(qū)119 bp（圖1）。其推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)理論分子量為48.25 ku，等電點(diǎn)為7.63。SignalP分析發(fā)現(xiàn)，該IDGF基因推導(dǎo)的氨基酸序列中存在信號(hào)肽序列（MKILICALLALAAYVAA）。氨基酸序列同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，黃粉甲IDGF與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）IDGF的相似性為89%，與蔗根非耳象（Diaprepes abbreviatus）IDGF的相似性為71%（圖2）。MotifScan分析發(fā)現(xiàn)，該IDGF基因cDNA序列中存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（NSSV216-219），1個(gè)依賴cGMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（RKGT360-363），5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（TILE116-119、SVVD176-179、SKEE322-325、SYPE329-332、TLDD408-411），6個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)（GLDLAW142-147、GLLLTL204-209、GAPNNK279-284、GIWVGY376-381、GNKASY388-393、GLCTGD414-419），5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（SDK18-20、SYK64-66、TFR199-201、TPK242-244、SKR358-360），2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（RNPKEADY245-252、RKFDENADY262-270），第119位點(diǎn)至第137位點(diǎn)是一個(gè)未知蛋白功能結(jié)構(gòu)域，第19位點(diǎn)至第410位點(diǎn)氨基酸區(qū)域是18糖基水解酶家族的保守結(jié)構(gòu)域。利用MEGA 5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示黃粉甲IDGF與赤擬谷盜IDGF聚在一起，進(jìn)化關(guān)系最近（圖3）。

2.2 IDGF基因的表達(dá)特征

在不同發(fā)育階段，IDGF基因在幼蟲1齡和2齡中的表達(dá)量明顯高于其他發(fā)育階段，成蟲次之，蛹期表達(dá)量最低（圖4）。在蛹期不同組織中，IDGF基因在脂肪體中的表達(dá)量最高，血細(xì)胞次之，而表皮中幾乎沒有表達(dá)（圖5）。被管氏腫腿蜂寄生后，IDGF基因的表達(dá)不會(huì)發(fā)生顯著變化，表明寄生未對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用（圖6）。

3 結(jié)論與討論

通過RACE技術(shù)克隆獲得的IDGF基因推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)分子量為48.25 ku，與先前報(bào)道的黑腹果蠅IDGF家族基因約為50 ku和菜粉蝶（Pieris rapae）IDGF為52 ku大小相近[1，18]。Varela等在果蠅IDGF-2基因研究中發(fā)現(xiàn)其含有18糖基水解酶家族，黃粉甲IDGF基因氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)也存在18糖基水解酶家族保守結(jié)構(gòu)域[11]。

在果蠅IDGF研究中發(fā)現(xiàn)，IDGF在果蠅胚胎卵黃細(xì)胞、胚胎和幼蟲中均有表達(dá)，但在幼蟲期表達(dá)顯著[1-2]。通過對(duì)意大利蜜蜂（Apis mellifera）工蜂幼蟲不同日齡IDGF基因的表達(dá)特征研究表明，該基因在幼蟲期表達(dá)顯著[19]。與這些研究結(jié)果相似，黃粉甲IDGF在幼蟲1齡和2齡的表達(dá)量顯著高于蛹和成蟲階段。在果蠅幼蟲中，IDGF基因在脂肪體中的顯著表達(dá)[2，20]。在菜粉蝶中，IDGF在脂肪體和血細(xì)胞中均有表達(dá)，但脂肪體中的表達(dá)量明顯高于血細(xì)胞中的表達(dá)量[10，21]。同樣，黃粉甲IDGF基因在脂肪體中顯著表達(dá)，且明顯高于血細(xì)胞中的表達(dá)量。管氏腫腿蜂寄生黃粉甲蛹后，IDGF基因不受寄生所調(diào)控，這與Asgari等報(bào)道的菜粉蝶被微紅盤絨繭蜂寄生和注射多份DNA病毒后IDGF基因的表達(dá)沒有受到影響[18]以及Zhu等所報(bào)道的菜粉蝶被蝶蛹金小蜂寄生后IDGF轉(zhuǎn)錄水平不受影響[21]的結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，黃粉甲IDGF基因應(yīng)不受寄生蜂所攜帶的寄生因子所調(diào)控。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hipfner D R，Cohen S M. New growth factors for imaginal discs[J]. BioEssays，1999，21（9）：718-720.

[2]Kawamura K，Shibata T，Saget O，et al. A new family of growth factors produced by the fat body and active on Drosophila imaginal disc cells[J]. Development，1999，126（2）：211-219.

[3]Schweitzer R，Shaharabany M，Seger R，et al. Secreted spitz triggers the DER signaling pathway and is a limiting component in embryonic ventral ectoderm determination[J]. Genes & Development，1995，9（12）：1518-1529.

[4]Neuman-Silberberg F S，Schüpbach T. The drosophila dorsoventral patterning gene gurken produces a dorsally localized RNA and encodes a TGF alpha-like protein[J]. Cell，1993，75（1）：165-174.

[5]Sutherland D，Samakovlis C，Krasnow M A. Branchless encodes a drosophila FGF homolog that controls tracheal cell migration and the pattern of branching[J]. Cell，1996，87（6）：1091-1101.

[6]Gelbart W M. The decapentaplegic gene：a TGF-β homologue controlling pattern formation in Drosophila[J]. Development，1989，107（Suppl）：65-74.

[7]Capdevila J，Guerrero I. Targeted expression of the signaling molecule decapentaplegic induces pattern duplications and growth alterations in Drosophila wings[J]. The EMBO Journal，1994，13（19）：4459-4468.

[8]Pignoni F，Zipursky S L. Induction of drosophila eye development by decapentaplegic[J]. Development，1997，124（2）：271-278.

[9]Neumann C J，Cohen S M. Distinct mitogenic and cell fate specification functions of wingless in different regions of the wing[J]. Development，1996，122（6）：1781-1789.

[10]Zhang J，Iwai S，Tsugehara T，et al. MbIDGF，a novel member of the imaginal disc growth factor family in Mamestra brassicae，stimulates cell proliferation in two lepidopteran cell lines without insulin[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2006，36（7）：536-546.

[11]Varela P F，Llera A S，Mariuzza R A，et al. Crystal structure of imaginal disc growth factor-2. A member of a new family of growth-promoting glycoproteins from Drosophila melanogaster[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，277（15）：13229-13236.

[12]Zhu J Y，Yang P，Zhang Z，et al. Transcriptomic immune response of Tenebrio molitor pupae to parasitization by Scleroderma guani[J]. PLoS One，2013，8（1）：e54411.

[13]Thompson J D，Gibson T J，Higgins D G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX[M]//Current protocols in bioinformatics. New York：John Wiley and Sons，2002：1-22.

[14]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[15]Zhu J Y，Ze S Z，Stanley D W，et al. Parasitization by scleroderma guani influences expression of superoxide dismutase genes in tenebrio molitor[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2014，87（1）：40-52.

[16]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[17]賈麗艷，杜 強(qiáng).SPSS統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)準(zhǔn)教程[M]. 北京：人民郵電出版社，2005.

[18]Asgari S，Schmidt O. Isolation of an imaginal disc growth factor homologue from Pieris rapae and its expression following parasitization by Cotesia rubecula[J]. Journal of Insect Physiology，2004，50（8）：687-694.

[19]李華瑋，何金環(huán)，鄭 鳴.王漿高產(chǎn)蜜蜂工蜂幼蟲發(fā)育期肽質(zhì)量指紋圖譜的建立[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，41（3）：19-26.

[20]Kirkpatrick R B，Matico R E，Mcnulty D E，et al. An abundantly secreted glycoprotein from Drosophila melanogaster is related to mammalian secretory proteins produced in rheumatoid tissues and by activated macrophages[J]. Gene，1995，153（2）：147-154.

[21]Zhu J Y，F(xiàn)ang Q，Ye G Y，et al. Proteome changes in the plasma of Pieris rapae parasitized by the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum[J]. Journal of Zhejiang University：Science，2011，12（2）：93-102. 焦念元，汪江濤，尹 飛，等. 化學(xué)調(diào)控與施磷肥對(duì)玉米花生間作光合物質(zhì)積累和產(chǎn)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：99-104.