石娜娜　王波　王玉芳　高坤

摘 要 由單因素和正交實驗優(yōu)化得到了P-24菌株的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：蔗糖25，檸檬酸鈉3，乙酸鈉2，酵母粉8，蛋白胨5，玉米漿20，MgSO4*7H2O 0.4，K2HPO4 1.0，pH值6.2～6.6。通過3 L發(fā)酵罐小試，發(fā)酵過程中進行pH的調(diào)節(jié)和補糖，使乳酸片球菌P-24的生物量提高了9倍，有效活菌數(shù)達9×1010 CFU/mL。

關(guān)鍵詞 乳酸片球菌；生物量；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號：TQ920.6 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）01--02

乳酸片球菌乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，P.a）是一種動物體內(nèi)的益生菌，是一種常見的乳酸菌?？芍苯討?yīng)用于動物飼料、動物喂食和青貯飼料中。在飼料中能抑制腐敗微生物的生長，解決飼料腐敗問題，提高飼料適口性和消化率[1]。乳酸片球菌在香腸發(fā)酵中具有較高的競爭性和環(huán)境適應(yīng)性[2]。其在肉制品發(fā)酵中產(chǎn)酸，使pH下降，賦予其特有的風味。另外，乳酸片球菌產(chǎn)生的各種酶類物質(zhì)，可使肉中的蛋白質(zhì)分解為人體易吸收的物質(zhì)，提高其產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。

目前，對乳酸片球菌的研究主要集中在生產(chǎn)應(yīng)用領(lǐng)域，但對發(fā)酵工藝方面的研究卻很少，大部分用傳統(tǒng)MRS培養(yǎng)基進行發(fā)酵，但它的成本高，活菌數(shù)少，本實驗對P-24的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，降低了生產(chǎn)成本，有效提高了活菌數(shù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

乳酸片球菌C1C-1241，濰坊工程職業(yè)學(xué)院生化學(xué)院保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

出發(fā)培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母粉5、檸檬酸氫二銨2、乙酸鈉5、磷酸氫二鉀2、硫酸鎂0.58、硫酸錳0.25。

1.3 生物量的檢測

在600 nm處對菌體溶液進行比色，根據(jù)濁度判定生物量。

1.4 單因素優(yōu)化

將MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖，替換為蔗糖、麥芽糖、乳糖及液化淀粉；檸檬酸氫二銨替換為檸檬酸鈉；蛋白胨+酵母粉替換為酵母粉、蛋白胨、玉米漿、蛋白胨+酵母粉、酵母粉+玉米漿、酵母粉+蛋白胨+玉米漿，確定最佳碳源和氮源。

向MRS培養(yǎng)基中添加不同濃度的硫酸鎂、磷酸氫二鉀和硫酸錳，確定最佳無機鹽種類和濃度。

1.5 正交優(yōu)化試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇蔗糖、蛋白胨、檸檬酸鈉設(shè)計三因素三水平正交實驗，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。見表1。

1.6 3 L發(fā)酵罐初始試驗

用優(yōu)化后的培養(yǎng)基在3 L發(fā)酵罐中初試，發(fā)酵過程中用8 mol/L的NaOH控制發(fā)酵液pH在5.5～6.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 最佳碳源、氮源

以蔗糖為碳源時，OD600為4.043，選擇蔗糖作為最佳碳源。以酵母粉+蛋白胨+玉米漿為氮源時OD600值3.281，與蛋白胨+酵母粉相差無異，但考慮到生產(chǎn)成本，選擇酵母粉+蛋白胨+玉米漿作為氮源。

檸檬酸氫二銨成本較高，為降低成本，用等量的檸檬酸鈉將其代替，通過生物量的比較發(fā)現(xiàn)，能提高其生物量OD600為3.521。

2.1.2 最佳無機鹽種類及濃度

添加0.4 g/L的Mg2+時發(fā)酵液的生物量最大，OD600為3.500；添加1g/L的K2HPO4時發(fā)酵液的生物量最大，OD600為3.728；Mn2+不利P-24的發(fā)酵，不添加。

2.2 正交優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，進行蔗糖、檸檬酸鈉和蛋白胨三因素正交實驗，各因素影響順序為蛋白胨>檸檬酸鈉>蔗糖，最優(yōu)組合為A2B3C1?？傻玫絻?yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基為（g/L）：蔗糖25，檸檬酸鈉3，乙酸鈉2，蛋白胨5，酵母粉5，玉米漿12，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.4，此配方下生物量OD600為4.700。

2.3 3 L發(fā)酵罐初試及結(jié)果

將優(yōu)化后培養(yǎng)基在3 L發(fā)酵罐上初試，6 h后通過級聯(lián)控制滴加NaOH，使pH在5.5～6.0以及6.0～6.5范圍內(nèi)波動，直至發(fā)酵結(jié)束，選擇最適pH范圍。

從圖1可以看出，該菌pH從0～8 h一直在下降，而控制發(fā)酵液pH可以提高菌體生物量。當pH在5.5～6.0時，更適合菌體的生長，此時OD600為11.820，有效活菌數(shù)為6.8×1010 CFU/mL。

在發(fā)酵培養(yǎng)至8h時開始補料，向發(fā)酵罐中一次補入10 mL葡萄糖溶液，之后每隔2 h進行一次補料，共補料3次，發(fā)酵至25 h結(jié)束，此時P-24有效活菌數(shù)為90億/mL，菌體OD600為13.5～14.0。

3 結(jié)論

乳酸片球菌在動物飼料、青貯飼料、食品等方面均有重要的應(yīng)用價值，采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基并再發(fā)酵過程中控制pH，提高了乳酸片球菌的菌體量，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵方法對其生物菌劑的生產(chǎn)提供了重要參考。

參考文獻

[1]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

[2]楊華.發(fā)酵劑及抗氧化劑對鯰魚發(fā)酵香腸品質(zhì)的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010（9）.

（責任編輯：趙中正）