惠 景，李曉飛，朱欣婷，姜勝男，晏 容，范 芳，劉 云

(1.遵義醫(yī)學院 貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院生化教研室，貴州 遵義 563099)

基礎醫(yī)學研究

3種斑蝥素堿土金屬鹽類衍生物對HepG2人肝癌細胞生長的抑制作用

惠 景1,2，李曉飛1,2，朱欣婷1,2，姜勝男2，晏 容1,2，范 芳1,2，劉 云1

(1.遵義醫(yī)學院 貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院生化教研室，貴州 遵義 563099)

目的 比較3種斑蝥素堿土金屬鹽類衍生物對人肝癌細胞HepG2的抑制增殖及促凋亡作用。方法 采用3種斑蝥素鹽類衍生物分別對體外培養(yǎng)的肝癌細胞HepG2進行干預，磺酰羅丹明染色法(SRB 法)檢測細胞增殖抑制作用；相差顯微鏡結合Hoechst33342染色觀察細胞形態(tài)學變化；流式細胞技術檢測細胞凋亡。結果 3種斑蝥素鹽類衍生物均呈濃度依賴性抑制人肝癌細胞HepG2的生長，尤以斑蝥素酸鎂的抑制效應最強(P<0.05)；斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞HepG2的形態(tài)影響比斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶明顯；Hoechst 33342染色顯示斑蝥素酸鎂致HepG2細胞出現(xiàn)凋亡細胞形態(tài)特征比斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶明顯；流式細胞術檢測結果表明，同一濃度3 μg/mL的斑蝥素酸鎂的促進凋亡作用明顯高于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶(P<0.05)。結論 3種斑蝥素鹽類衍生物均具有抑制人肝癌細胞HepG2增殖并促其凋亡的作用，但斑蝥素酸鎂的作用明顯強于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶。

斑蝥素酸鎂；斑蝥素酸鈣；斑蝥素酸鍶；人肝癌細胞HepG2；抗腫瘤

斑蝥素(Cantharidin)是芫菁科昆蟲體內產生的活性物質，研究表明它能夠治療多種癌癥，包括肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、口腔鱗狀細胞癌和結腸癌等[1-3]。本課題組前期研究也表明斑蝥素類物質能通過干預腫瘤細胞周期的變化，達到抑制腫瘤細胞增殖的目的[4]。作為臨床化療藥物，其最大優(yōu)點是不會降低癌癥患者體內的白細胞數(shù)量水平，對于肝癌的治療效果最為明顯[5]。但是，斑蝥素會對泌尿系統(tǒng)和腎臟帶來毒副作用。因此，目前該領域的研究熱點是：開發(fā)一系列具有抑癌作用的 斑蝥素衍生物，使其在保留治療效果的同時，能最大限度的降低生物毒性[6-7]。

本課題組前期工作以斑蝥素為原料合成了多種斑蝥素鹽類衍生物，包括斑蝥素酸鈉、斑蝥素酸鎂和斑蝥素酸鉀等，并對其抗癌活性做了報道[8-9]；研究發(fā)現(xiàn)鎂元素與斑蝥素相結合后，能顯著提升斑蝥素的活性，改善其水溶性。鎂元素為第二主族第三周期的元素，在這個主族中，鎂(Mg)和鈣(Ca)都是人類所需礦物質的常量元素，在作為酶的激活劑和保持神經肌肉興奮性等方面具有重要作用，是維持生命代謝不可替代的重要元素[10-12]。該主族的鍶(Si)元素作為人體所需的微量元素能防止腦血栓形成[13]和骨質的流失[14]。而在第二主族元素中鈹、鋇、鐳的攝取會對人體造成傷害。因此，本研究選擇合成了斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶3種斑蝥素的鹽類衍生物，擬考察與鎂元素處于同一主族的其它金屬元素(如鈣、鍶)與斑蝥素結合后的抗癌活性差異，為進一步評價此類衍生物的不同抗癌應用前景奠定實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 斑蝥素酸鎂由自制斑蝥素合成，制備方法已授權國家發(fā)明專利[15]，斑蝥素酸鈣、斑蝥素酸鍶的合成方法參考斑蝥素酸鎂完成。細胞實驗前，先用去離子水將上述3種衍生物分別配置成1.2 mg/mL的母液備用。

1.1.2 肝癌細胞株 人肝癌細胞HepG2購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.1.3 試劑 磺酰羅丹明(SRB)購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、南美胎牛血清和胰蛋白酶購自美國HYCLONE公司；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、Hoechst33342染液為碧云天生物技術有限公司產品。

1.1.4 主要儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱和Multiskanspectrum全波長酶標儀購于美國Thermo公司；NikonYS100顯微鏡購于日本Nikon公司；FACS Calibur流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞的培養(yǎng) 人肝癌HepG2細胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%的南美胎牛血清)在37 ℃、5% CO2和60%的濕度下培養(yǎng)。待細胞生長融合度至80%～90%時，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2～3遍，用0.25%胰蛋白酶消化后，加培養(yǎng)液吹打均勻，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。本研究共分為4個組：分別為對照組，斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣、斑蝥素酸鍶干預組，給藥方式為將藥物配置成對應濃度的母液再直接混合到培養(yǎng)基中。

1.2.3 人肝癌細胞HepG2形態(tài)變化 接種100 μL細胞于96孔板中(8 000 個細胞)，37 ℃、5% CO2和60%的濕度下培養(yǎng)20 h后，再加入斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶，終濃度為3 μg/mL，對照組加100 μL培養(yǎng)基，每組設3個平行孔，培養(yǎng)48 h后，通過普通光學顯微鏡觀察HepG2細胞形態(tài)變化。然后PBS洗1遍，加入4%多聚甲醛固定15 min，棄固定液，PBS洗1遍，加Hoechst 33342染色液100 μL避光染色25 min，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學特征。

1.2.4 流式細胞技術檢測細胞凋亡 接種1 mL細胞于6孔板中(2×105個細胞)，37 ℃、5% CO2和60%的濕度下培養(yǎng)20 h后，加入斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶，藥物終濃度均為3 μg/mL。實驗設3個重復，同時設置空白對照組。將培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結果

2.1 3種斑蝥素鹽類衍生物對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用 由圖1可知，3種斑蝥素鹽類衍生物對人肝癌細胞HepG2的增殖都具有抑制作用。在給藥24 h后，其受試物在濃度0.375～6.000 μg/mL范圍內抑制作用隨濃度增加而增加，量效關系明顯。其中斑蝥素酸鎂的抑制肝癌細胞的活性明顯好于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶(P<0.05)。

A：作用時間24 h；B：作用時間48 h；C：作用時間72 h。圖1 3種斑蝥素鹽類衍生物對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用

2.2 3種斑蝥素鹽類衍生物對人肝癌細胞HepG2形態(tài)的影響 如圖2所示，3 μg/mL的斑蝥素酸鎂作用于人肝癌細胞HepG2 48 h后，細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮變圓，而相同濃度的斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶的抑制效果明顯不如斑蝥素酸鎂。經Hoechst 33342染色后，3 μg/mL斑蝥素酸鎂作用于人肝癌細胞HepG2細胞24 h后，細胞數(shù)量減少，細胞核固縮、致密濃染呈藍色，而相同濃度的斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶對人肝癌細胞HepG2的作用效果明顯弱于斑蝥素酸鎂。

A:空白對照組；B:斑蝥素酸鎂；C：斑蝥素酸鈣；D:斑蝥素酸鍶。A1、B1、C1、D1為相差顯微鏡所見；A2、B2、C2、D2為Hoechst33342染色結果。圖2 3種斑蝥素衍生物對人肝癌細胞HepG2形態(tài)的影響

2.3 3種斑蝥素鹽類衍生物對人肝癌細胞HepG2的促凋亡作用 終濃度為3 μg/mL的斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶分別作用于人肝癌細胞HepG2 24 h后，流式細胞術散點圖檢測顯示早期凋亡細胞的存在(見圖3)，其中斑蝥素酸鎂促進肝癌HepG2細胞發(fā)生早期凋亡的能力明顯強于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶(P<0.05)。

A:空白對照組；B:斑蝥素酸鎂；C：斑蝥素酸鈣；D:斑蝥素酸鍶。n=3,*：P<0.05。圖3 流式細胞術檢測3種斑蝥素鹽類衍生物對肝癌細胞HepG2的促凋亡作用

3 討論

斑蝥素是從我國珍貴傳統(tǒng)中藥斑蝥中提取的并已確定結構的抗癌藥物，其具有良好的廣譜抗腫瘤活性。目前，國內外研究人員通過改造斑蝥素結構，合成衍生物，研究其抗癌活性及機理。還有研究人員將斑蝥素與其它化療藥物或靶向物質聯(lián)用，尋求更好的治療癌癥效果[16-19]。這些都說明斑蝥素具有極強的改造潛力、研究價值和發(fā)展前景[20-21]。

本實驗研究結果顯示，3種斑蝥素鹽類衍生物均具有抑制人肝癌細胞HepG2增殖并促其凋亡的作用，但斑蝥素酸鎂的作用明顯強于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶。從上述結果可以看出隨著第二主族中原子半徑的增加，斑蝥素相關鹽類衍生物的抗腫瘤活性在降低。雖然鎂、鈣、鍶都屬于第二主族元素，但是就個體屬性而言，鎂元素的堿土性質明顯低于鈣元素和鍶元素。此外，鎂離子還是細胞中多種酶的輔助因子和激活劑，參與細胞分裂、生長、凋亡，在整個細胞周期中起著非常重要的作用。國內外研究人員發(fā)現(xiàn)攝入一定量的鎂元素能降低化療帶來的副作用[22]，并且鎂元素的攝入與腫瘤發(fā)生率之間呈現(xiàn)某種相關性[23]：比如長時間的跟蹤調查顯示鎂元素的攝取會有利于初期胰腺癌的抑制[24]。通過對癌癥患者體內微量元素的檢測也證實正常人與患者體內鎂元素含量有顯著差異[25]：子宮肌瘤組織中的鎂元素明顯低于正常組織。這些研究表明鎂元素與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有某種潛在的關系，在斑蝥素的結構上引入鎂元素后表現(xiàn)出的良好抗癌活性，有可能是斑蝥素和鎂元素在抗癌方面的優(yōu)勢進行了疊加。另外，三種斑蝥素鹽類衍生物的毒性還未評價，這些研究將后續(xù)跟進。課題組希望通過本研究，能為抗癌藥物研究工作者在合成其他抗腫瘤鹽類衍生物的時候，提供一點提示。

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收稿2016-10-02;修回2016-11-07〗

(編輯：王靜)

The inhibitory effects of three alkaline earth metal cantharidate derivatives on HepG2 Cells

HuiJing1,2,LiXiaofei1,2,ZhuXinting1,2,JiangShengnan1,2,YanRong1,2,FanFang1,2,LiuYun1

(1.Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Biochemistry,Basic Medical College,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To test and compare the effects of three alkaline earth metal cantharidate derivatives on inhibiting proliferation and promoting apoptosis in hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Methods Three cantharidate derivatives were added to HepG2 cells and cell growth inhibition was measured by the sulforhodamine B (SRB) assay.Morphological changes were observed through phase contrast microscope with Hoechst 33342 staining.Flow cytometry (FCM) was used to measure apoptosis of HepG2 cells.Results All the cantharidate derivatives could inhibit the proliferation of HepG2 cells concentration-dependently and magnesium cantharidate was the best(P<0.05).Magnesium cantharidate had the greatest influence on morphological changes of HepG2 cells among three derivatives.Hoechst 33342 staining indicated that the morphological changes caused by apoptosis of HepG2 cells was most obvious with magnesium cantharidate among three derivatives.Magnesium cantharidate had the greatest influence on promoting apoptosis of HepG2 cells among three cantharidate derivatives with the same concentration (3 μg/ml) (P<0.05).Conclusion All three cantharidate derivatives could inhibit the proliferation and promote the apoptosis of HepG2 cells in vitro.In terms of the effects,magnesium cantharidate was the best.

magnesium cantharidate；calcium cantharidate；strontium cantharidate；hepatocellular carcinoma cells HepG2；anti-tumor

國家自然科學基金資助項目(NO：81560669，81260488)；貴州省科技合作計劃項目(NO：黔科合LH字20157509，黔科合LH字2015〗7516)；貴州省衛(wèi)計委科學技術基金資助項目(NO：gzwjk2015-1-013)；貴州省教育廳特色重點實驗室建設項目(NO：黔教合KY字2014〗212)。

劉云，男，博士，副教授，研究方向：小分子抗癌藥物研究與開發(fā)，E-mail:liuyunzy@126.com。

R739.65

A

1000-2715(2016)06-0568-05