胡 睿，孫夢婕，秦 穎，肖 智

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

恩再適對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究

胡 睿1，孫夢婕1，秦 穎2，肖 智2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

目的 觀察恩再適(analgecine)對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用以及對中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)外側(cè)區(qū)(lPAG)P2X7受體表達(dá)的影響，明確恩再適對神經(jīng)病理性疼痛大鼠鎮(zhèn)痛的初步機(jī)制。方法 建立SD大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓榨性損傷(CCI)模型；通過在外周受損神經(jīng)周圍注射不同劑量恩再適后觀察其對CCI大鼠機(jī)械痛閾值(MWT)和lPAG中P2X7受體表達(dá)的影響；CCI大鼠lPAG微量注射P2X7受體拮抗劑A-740003對恩再適鎮(zhèn)痛作用的影響。結(jié)果 CCI大鼠經(jīng)多次外周注射恩再適后，大鼠機(jī)械痛閾值逐漸增高(P<0.001)，說明局部注射恩再適對CCI大鼠具有鎮(zhèn)痛作用；CCI大鼠外周注射恩再適后，lPAG中P2X7受體表達(dá)上調(diào)(P<0.001)，其上調(diào)幅度與注射恩再適劑量相關(guān)。另取建模后14 d經(jīng)多次外周注射恩再適的CCI大鼠，觀察發(fā)現(xiàn)：大鼠lPAG微量注射P2X7受體拮抗劑A-740003可削弱外周注射恩再適的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)論 恩再適對神經(jīng)病理性疼痛大鼠有鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制與促進(jìn)lPAG中P2X7受體激活有關(guān)。

恩再適；神經(jīng)病理性疼痛；中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)；P2X7受體

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是一種慢性持續(xù)性疼痛，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏或超敏、感覺異常等。目前臨床治療神經(jīng)病理性疼痛的方法較多，最主要的仍以藥物治療為主，常用的鎮(zhèn)痛藥物有阿片類藥物、非甾體類藥物、三環(huán)類抗抑郁藥物、抗癲癇藥物、鈣通道阻斷劑等，然而這些藥物療效不一，并且具有不同程度的副作用，在臨床上限制了其使用范圍，因此，臨床致力尋找鎮(zhèn)痛效果好且副作用小，安全的鎮(zhèn)痛新藥。

近年來，牛痘疫苗接種家兔炎癥皮膚提取物[包括神經(jīng)妥樂平(neurotropin)和恩再適(analgecine)]越來越廣泛地應(yīng)用于神經(jīng)病理性疼痛的臨床鎮(zhèn)痛治療。它是在健康家兔皮內(nèi)接種人用牛痘病毒活疫苗，經(jīng)過炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)產(chǎn)生的非蛋白小分子生物活性物質(zhì)。牛痘疫苗致炎兔皮提取物是一種具有神經(jīng)親和性的生物制劑，研究提示其主要作用機(jī)制是調(diào)節(jié)神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能。

中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueductal gray，PAG)是機(jī)體內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的關(guān)鍵部位，特別是其外側(cè)區(qū)(lateral periaqueductal gray，lPAG)，在疼痛形成和維持機(jī)制中均有重要作用[1]。5'-三磷酸腺苷(adenosine-5'-triphosphate，ATP)是一種快速的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)膠質(zhì)遞質(zhì)，參與機(jī)體多種生理及病理功能的調(diào)節(jié)。ATP受體分為P1(腺苷)和P2(嘌呤)兩類受體，ATP及其受體參與了疼痛信息的傳導(dǎo)和調(diào)制[2-3]。P2X7受體是P2X家族中一個(gè)獨(dú)特的亞型，屬于配體門控的陽離子通道，在中樞神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。近年P(guān)2X7受體在疼痛形成和維持機(jī)制中的作用成為疼痛研究的熱點(diǎn)之一。

對于牛痘疫苗致炎兔皮提取物的鎮(zhèn)痛機(jī)制中是否有l(wèi)PAG中P2X7受體的介入未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，因此，探討牛痘疫苗致炎兔皮提取物的鎮(zhèn)痛機(jī)制與lPAG中P2X7受體的關(guān)系是本研究的主要目的。本實(shí)驗(yàn)將建立慢性神經(jīng)壓榨性損傷(chronic constriction injury，CCI)所致的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，通過在受損的坐骨神經(jīng)旁多次注射不同劑量恩再適，觀察恩再適是否對神經(jīng)病理性疼痛大鼠具有鎮(zhèn)痛作用并探討其鎮(zhèn)痛機(jī)制是否有l(wèi)PAG中P2X7受體的介入。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共108只購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。體重210～220 g，實(shí)驗(yàn)期間分籠飼養(yǎng)，3～4只大鼠1籠；大鼠置于安靜，溫度(24±1)℃，濕度(60±5)%，人工光照，明暗各12 h/d(8AM～8PM)周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。本研究嚴(yán)格按照國際疼痛研究協(xié)會(International Association for the Study of Pain，IASP)關(guān)于應(yīng)用動物進(jìn)行疼痛研究的倫理綱要進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)過程中盡量減少動物的不適和動物的使用量。

按照隨機(jī)數(shù)字表法將84只大鼠隨機(jī)分為7組(n=12)：正常組(normal組)、假CCI組(Sham-CCI組)、CCI組(CCI組)、CCI+生理鹽水組(CCI+NS組)、CCI+低劑量恩再適組(CCI+Low analgecine組)、CCI+中劑量恩再適組(CCI+Middle analgecine組)、CCI+高劑量恩再適組(CCI+High analgecine組)。CCI+NS組大鼠在損傷的坐骨神經(jīng)局部注射生理鹽水；CCI+低、中、高劑量恩再適組分別在損傷的坐骨神經(jīng)局部注射不同劑量(0.12、0.24、0.48 單位/0.4 mL)恩再適；在CCI手術(shù)后14 d每組取6只用于免疫組化檢測P2X7受體在lPAG中的表達(dá)，剩余6只觀察MWT值變化情況，直到CCI術(shù)后21 d。正常組不做任何處理，僅做對照。

另取SD大鼠24只建立CCI模型，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=8)：CCI組、CCI+analgecine組和CCI+A-740003+analgecine組。觀察lPAG內(nèi)微量注射A-740003對恩再適鎮(zhèn)痛作用的影響。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 電子VonFrey測痛儀(IITC Life science公司，2390系列，美國)、冰凍切片機(jī)(Leica CM1950，德國)、腦立體定位儀(Narishige公司，SR-6R，日本)、兔抗大鼠P2X7多克隆抗體(abcam公司，美國)、兔超敏二步法檢測試劑盒( PV-6001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、新生牛血清[平睿生物科技(北京)有限公司]、濃縮型DAB顯色試劑盒(ZLI-9301，北京中杉金橋生物有限公司)、恩再適(3.6單位/3 mL/支，威世藥業(yè)，江蘇)、A-740003(Tcris公司，英國)：溶于1%二甲基亞砜(dimethylsurferide,DMSO)，分裝后-20 ℃保存，lPAG微量注射前用生理鹽水稀釋至所需濃度，每次微量注射含100 nmol A-740003的生理鹽水0.5 μL。

1.3 動物模型建立 參照Bennett等[4]的方法制備大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓榨性損傷(CCI)模型。大鼠予以4%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后，于右后腿縱向切開皮膚，鈍性分離，暴露坐骨神經(jīng)主干，4-0絲線間斷結(jié)扎，間距1 mm，結(jié)扎強(qiáng)度以小腿肌肉輕微震顫為度。生理鹽水沖洗后逐層縫合。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，麻醉清醒后自由攝食及飲水。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎，余同模型組。

1.4 坐骨神經(jīng)旁注射 CCI建模成功后第7天，CCI+Low analgecine組、CCI+Middle analgecine 組和CCI+High analgecine組大鼠每組取6只，分別抽取0.12、0.24、0.48 單位/0.4 mL的恩再適注射液注射于大鼠損傷坐骨神經(jīng)旁，1 次/d，共注射7次，連續(xù)7 d。CCI+NS組大鼠在坐骨神經(jīng)周圍注入0.4 mL等量的NS，其余操作同前3組。注射部位定位方法：參照劉永峰等[5]的方法，在大鼠股骨大轉(zhuǎn)子和坐骨結(jié)節(jié)間皮膚進(jìn)針后向前內(nèi)側(cè)前進(jìn)，沿著坐骨神經(jīng)走行呈扇形注射藥液。

1.5 機(jī)械痛閾值的檢測 測定機(jī)械痛閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)時(shí)，室溫維持在20～24 ℃，保持周圍環(huán)境安靜。先將大鼠置于底帶孔的透明有機(jī)玻璃籠中30 min，使大鼠適應(yīng)環(huán)境，待大鼠停止行走、抓撓、直立、排便等活動處于安靜狀態(tài)后開始檢測。通過網(wǎng)孔用電子vonFrey纖維刺激大鼠后肢足底中部2 s，出現(xiàn)縮足反應(yīng)時(shí)讀數(shù)為MWT值。建模(CCI)前(0 d)和建模后1、3、5、7、9、12、14、18、21 d分別檢測大鼠MWT值。

1.6 中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)植管及微量注射 CCI+A-740003+analgecine組大鼠于CCI術(shù)后第9天給予4%水合氯醛腹腔麻醉(10 mL/kg)，麻醉成功后，大鼠俯臥位置于腦立體定位儀上，切開頭皮，暴露顱骨，鉆孔，在lPAG植管。lPAG的坐標(biāo)為：前囟后7.80 mm，中線旁開0.60 mm，顱骨表面下4.5 mm。插入外直徑(o.d.)0.8 mm插管，用牙科磷酸鋅水門釘固定，在插管內(nèi)放入一內(nèi)芯，防止插管堵塞。植管后給予青霉素鈉鹽(溶于2 mL無菌鹽水)腹腔注射預(yù)防感染。手術(shù)結(jié)束后放入籠中，保溫直到麻醉蘇醒。插管完成后，每日觀察大鼠的一般情況，生命體征以及運(yùn)動功能變化，如果出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙(癱瘓、呼吸異常、插管腦脊液漏等)，排除在實(shí)驗(yàn)組外。lPAG植管后5 d給予微量注射P2X7受體特異性拮抗劑A-740003，注射藥物前輕度固定大鼠，用微量進(jìn)樣器連接注射針頭后給予注射，注射針頭長于導(dǎo)管1 mm。每次注射100 nmol/0.5 μL，3 min內(nèi)注射完畢，留針2 min，確保藥物的完全擴(kuò)散。整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過微量進(jìn)樣器注入2%伊文思藍(lán) 0.2 μL，確定注射部位并與大鼠腦圖譜[6]比對，只有注射部位位于lPAG的大鼠數(shù)據(jù)才納入統(tǒng)計(jì)處理。

1.7 免疫組化 大鼠腹腔注射過量4%水合氯醛(20 mL/kg)。待大鼠肢體松弛，翻正反射消失后，迅速開胸，暴露心臟，灌注針經(jīng)心尖插至主動脈升部，予150 mL預(yù)冷的生理鹽水快速灌注，然后予4%多聚甲醛250 mL持續(xù)2～3 h緩慢灌注。斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液固定6 h后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液(4 ℃)中脫水。腦組織沉底后取出，冰凍包埋劑(OCT)包埋后-20 ℃冰凍切片機(jī)中速凍30 min，沿冠狀位連續(xù)切片，厚25 μm，每5～6張PAG切片取1張，每只大鼠取10張進(jìn)行免疫組化分析。免疫組織化學(xué)染色步驟：3%過氧化氫溶液室溫封閉40 min；正常牛血清室溫封閉1 h；加一抗：兔抗大鼠P2X7(1∶400)，37 ℃孵育1 h后轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱過夜；按說明加入兔超敏二步法檢測試劑，37 ℃孵育20 min；DAB顯色2～5 min，明膠貼片；自然風(fēng)干后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；封固后在光鏡下觀察并采集圖像。在切片放大200倍條件下，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對lPAG的陽性圖片進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。lPAG中細(xì)胞有細(xì)胞核、一個(gè)完整的胞體和細(xì)胞邊界算做1個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)，每張計(jì)數(shù)5個(gè)不重疊的視野，取均值。

2 結(jié)果

2.1 CCI大鼠疼痛行為學(xué)變化 大鼠CCI術(shù)后健康狀況良好，體重?zé)o明顯減輕，毛色有光澤，飲食正常。術(shù)側(cè)足趾展開且輕度外翻，常抬起并貼于腹部；站立時(shí)以左后足持重；右足行走無力，呈跛行狀態(tài)。常將右后肢抬起，有時(shí)出現(xiàn)舔舐、抓撓等，無自噬現(xiàn)象。正常組和假手術(shù)組未出現(xiàn)肢體畸形及活動異?，F(xiàn)象。

2.2 大鼠機(jī)械痛閾值變化 CCI術(shù)后大鼠建模側(cè)(右側(cè))后肢MWT值逐漸下降，在CCI手術(shù)后14 d達(dá)到最低值，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；其后MWT值逐漸上升，在CCI術(shù)后21 d，與正常組比較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；外周損傷神經(jīng)周圍注射不同劑量的恩再適后，CCI大鼠MWT值升高，各觀察時(shí)間點(diǎn)與CCI組大鼠比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且MWT升高值與恩再適注射劑量呈正相關(guān)，說明局部注射恩再適對CCI大鼠有鎮(zhèn)痛作用。假手術(shù)組大鼠MWT值在各觀察時(shí)間點(diǎn)與正常組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CCI+NS組大鼠MWT值在各觀察時(shí)間點(diǎn)與CCI組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

*P<0.001，與同時(shí)間點(diǎn)Control組(正常組)大鼠比較；#P<0.001，與同時(shí)間點(diǎn)CCI組大鼠比較；△P<0.001，與同時(shí)間點(diǎn)CCI+Low analgecine組大鼠比較；▲P<0.001，與同時(shí)間點(diǎn)CCI+Middle analgecine組大鼠比較。圖1 各觀察時(shí)間點(diǎn)大鼠機(jī)械痛閾變化曲線

2.3 lPAG中P2X7受體表達(dá)變化 取CCI手術(shù)后14 d各組大鼠(n=6)，免疫組化染色提示：P2X7受體表達(dá)于IPAG神經(jīng)元胞漿，正常組和假手術(shù)組大鼠在lPAG中僅有少量P2X7受體陽性細(xì)胞表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCI組大鼠lPAG中P2X7受體表達(dá)增加，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) ；外周損傷神經(jīng)周圍注射恩再適后，P2X7受體表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，與CCI 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且隨著注射恩再適劑量的增加，lPAG中P2X7受體的表達(dá)量增加；CCI +NS組大鼠lPAG中P2X7受體的表達(dá)與CCI組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明外周局部注射恩再適可促進(jìn)CCI大鼠lPAG中P2X7受體表達(dá)(見圖2A，2B)。

圖2A：各組同時(shí)間點(diǎn)大鼠lPAG中P2X7受體免疫組化陽性細(xì)胞圖；圖2B：P2X7受體陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。a：Control組；b：Sham-CCI組；c：CCI組；d：CCI+Low analgecine組；e：CCI+Middle analgecine組；f：CCI+High analgecine組；g：CCI+NS組。*P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)正常組大鼠比較；#P<0.001，與同時(shí)間點(diǎn)CCI組大鼠比較；△P<0.001，與同時(shí)間點(diǎn)CCI+Low analgecine組大鼠比較；▲P<0.001，與同時(shí)間點(diǎn)CCI+Middle analgecine組大鼠比較。圖2 CCI手術(shù)或恩再適注射后大鼠lPAG中P2X7受體表達(dá)的影響

2.4 lPAG微量注射A-740003對恩再適鎮(zhèn)痛作用的影響 取CCI建模后7 d大鼠，分為CCI組、CCI+analgecine組和CCI+A-740003+analgecine組(n=8)。CCI+analgecine組和CCI+A-740003+analgecine組于CCI建模7 d后分別給予0.48 單位/0.4 mL的恩再適注射于大鼠損傷坐骨神經(jīng)旁，1 次/d，共注射7次，連續(xù)7 d。在CCI手術(shù)后第14天，CCI+analgecine組大鼠坐骨神經(jīng)旁注射恩再適，MWT值在注射后10 min升高到最大值，此后在觀察時(shí)間內(nèi)(30 min)，MWT值無明顯變化；CCI+A-740003+analgecine組大鼠給予lPAG中微量注射P2X7受體拮抗劑A-740003(100 nmol/0.5 μL)5 min后，外周坐骨神經(jīng)周圍再給予0.48 單位/0.4 mL恩再適注射。觀察發(fā)現(xiàn)CCI+A-740003+analgecine組大鼠恩再適注射后10 min，MWT值上升達(dá)到最大值，與CCI組大鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；CCI+A-740003+analgecine組大鼠與CCI+analgecine組大鼠比較其MWT值上升幅度減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。CCI+A-740003+analgecine組大鼠隨后MWT值逐漸下降，在恩再適注射后30 min，其MWT值與CCI組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

*P<0.001，與CCI組大鼠比較；#P<0.001，與CCI+A-740003+analgecine組大鼠比較。圖3 A-740003預(yù)處理對恩再適鎮(zhèn)痛作用的影響

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損害和/或功能障礙引起的疼痛，臨床常見的神經(jīng)病理性疼痛有糖尿病神經(jīng)性疼痛、三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、惡性腫瘤或腫瘤治療后引起的神經(jīng)性疼痛等，嚴(yán)重影響患者的工作學(xué)習(xí)及生活質(zhì)量。牛痘疫苗接種家兔炎癥皮膚提取物用于治療神經(jīng)病理性疼痛在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，目前研究顯示牛痘疫苗致炎兔皮提取物主要有以下幾方面作用：①神經(jīng)修復(fù)及神經(jīng)營養(yǎng)；②鎮(zhèn)痛；③改善冷感、麻木等神經(jīng)癥狀；④免疫調(diào)節(jié)等。Masuguchi等[7]研究顯示神經(jīng)妥樂平可以緩解化療藥物-奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)引起的神經(jīng)病變，并通過激活Gi蛋白偶聯(lián)受體調(diào)控下行疼痛抑制系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。Okai等[8]采用在體細(xì)胞膜片鉗技術(shù)證實(shí)神經(jīng)妥樂平可以直接激活藍(lán)斑(locus coeruleus，LC)去甲腎上腺素能神經(jīng)元，通過下行性疼痛抑制系統(tǒng)抑制脊髓背角神經(jīng)元活動，緩解神經(jīng)病理性疼痛。Ryohei等[9]在研究神經(jīng)妥樂平的作用機(jī)制中還發(fā)現(xiàn)，在L5脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation，SNL)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中，靜脈給藥或側(cè)腦室注射神經(jīng)妥樂平均可有效治療疼痛，而外周足墊注射給藥不能止痛，這說明神經(jīng)妥樂平的鎮(zhèn)痛機(jī)制在中樞脊髓以上的結(jié)構(gòu)，而不是在外周。在本研究中，神經(jīng)病理性疼痛大鼠(CCI大鼠)外周損傷神經(jīng)周圍多次給予恩再適后，大鼠機(jī)械痛閾值上升，疼痛癥狀緩解，我們考慮其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能是局部注射恩再適對損傷的坐骨神經(jīng)具有修復(fù)和營養(yǎng)作用。該結(jié)論還需對損傷神經(jīng)做病理學(xué)和電生理學(xué)的進(jìn)一步研究。

P2X7受體是P2X家族中一個(gè)獨(dú)特的亞型，屬于配體門控的陽離子通道。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，P2X7受體表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，包括：星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。P2X7受體被ATP及其類似物激活后引起K+、Na+、Ca2+等陽離子跨膜運(yùn)動，對二價(jià)陽離子表現(xiàn)出相對較強(qiáng)的選擇性；同時(shí)，P2X7受體與其它P2X受體比較，其分子結(jié)構(gòu)有特殊性，表現(xiàn)為在二價(jià)陽離子或ATP的持續(xù)刺激下，激活的P2X7受體分子構(gòu)象出現(xiàn)變化，即快速由直徑0.8～1.1 nm的離子通道轉(zhuǎn)化為直徑3～5 nm的“膜孔”，該孔道可對分子量較大的物質(zhì)進(jìn)行通透[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體活化后引起Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，進(jìn)而激活下游多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生不同生理或病理效應(yīng)。Chassell等[11]的研究顯示，P2X7受體基因缺失小鼠，其機(jī)械痛敏及熱痛敏均未能出現(xiàn)，其IL-1β釋放減少，提示P2X7受體在外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛中扮演著非常重要的角色。Chu等[12]的研究顯示大鼠給予強(qiáng)直刺激坐骨神經(jīng)后脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體水平顯著升高，應(yīng)用siRNA抑制或P2X7受體拮抗劑BBG或oxATP后，可明顯阻斷坐骨神經(jīng)強(qiáng)直刺激誘發(fā)的脊髓C纖維場電位的長時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation，LTP)，并可緩解機(jī)械性痛覺超敏。Jiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CCI大鼠模型建立后，機(jī)械痛閾值和熱痛閾值下降，術(shù)后3 d脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體表達(dá)迅速上調(diào)，利魯唑可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活下調(diào)P2X7受體表達(dá)，降低炎性細(xì)胞因子MAPK信號通路的激活，緩解CCI大鼠的疼痛。

PAG是機(jī)體疼痛調(diào)制的關(guān)鍵部位，多種神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)以及受體等參與PAG對疼痛信息的處理。本研究發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠lPAG中僅有少量P2X7受體陽性表達(dá)；CCI術(shù)后大鼠lPAG中P2X7受體表達(dá)上調(diào)，考慮為CCI手術(shù)引起的疼痛信息上傳后激活機(jī)體的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)，引起lPAG中P2X7受體表達(dá)量增多；外周損傷給予多次恩再適局部注射后，CCI大鼠機(jī)械痛閾值顯著升高，且P2X7受體在lPAG的陽性表達(dá)進(jìn)一步增加，并與恩再適劑量呈正相關(guān)，說明外周局部注射恩再適可以促進(jìn)CCI大鼠lPAG中P2X7受體的表達(dá)。A-740003是目前最常使用的P2X7受體拮抗劑，具有高效、高選擇性及高安全性的特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，nmol濃度的A-740003即可抑制大鼠和人P2X7受體的功能。本研究也發(fā)現(xiàn)，預(yù)先在lPAG中微量注射P2X7受體特異性拮抗劑A-740003后，可以部分翻轉(zhuǎn)恩再適的鎮(zhèn)痛作用，說明恩再適通過激活lPAG中P2X7受體，加強(qiáng)機(jī)體的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)作用，進(jìn)而對CCI大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。對于外周注射恩再適引起lPAG中P2X7受體表達(dá)增加的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索明確。

綜上所述，通過本研究，可認(rèn)為注射恩再適能有效緩解CCI大鼠的疼痛，為臨床應(yīng)用牛痘疫苗致炎兔皮提取物治療神經(jīng)病理性疼痛提供了新的理論依據(jù)。

[1] Millan M J.Descending control of pain[J].Prog Neurobiol,2002,66(6):355-474.

[2] Sara G.ATP and pain[J].Pain Practice,2002,2(4):289-294.

[3] Zhuo M,Wu G X,Wu L J.Neuronal and microglial mechanisms of neuropathic pain[J].Molecular Brain,2011,4(1):1-12.

[4] Bennett G J,Xie Y K.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J].Pain,1988,33(1):87-107.

[5] 劉永峰,楊承祥.坐骨神經(jīng)周圍注射可樂定對CCI大鼠促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,25(5):19-22.

[6] Paxinos G,Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates[M].Amsterdam:Academic Press (sixth edition),2007:74-76.

[7] Masuguchi K,Watanabe H,Kawashiri T,et al.Neurotropin?relieves oxaliplatin-induced neuropathy via Gi protein-coupled receptors in the monoaminergic descending pain inhibitory system[J].Life Sciences,2014,98(1):49-54.

[8] Okai H,Okazaki R,Kawamura M,et al.Excitatory effect of Neurotropin?on noradrenergic neurons in rat locus coeruleus[J].Life Sciences,2015,136:79-86.

[9] Ryohei O,Hiroyoshi N,Hiroyuki Y,et al.The antiallodynic effect of neurotropin?is mediated via activation of descending pain inhibitory systems in rats with spinal nerve ligation[J].Anesth Analg,2008,107(3):1064-1069.

[10] Mehalick M L,Ingram S L,Aicher S A,et al.Chronic inflammatory pain prevents tolerance to the antinociceptive effect of morphine microinjected into the ventrolateral periaqueductal gray of the rat[J].J Pain,2013,14(12):1601-1610.

[11] Chessell I P,Hatcher J P,Bountra C,et al.Disruption of the P2X7purinoceptor gene abolishes chronic inflammatory and neuropathic pain[J].Pain,2005,114(3):386-396.

[12] Chu Y X,Zhang Y,Zhang Y Q, et al.Involvement of microglial P2X7receptors and downstream signaling pathways in long-term potentiation of spinal nociceptive responses[J].Brain Behav Immun,2010,24(7):1176-1189.

[13] Jiang K,Zhuang Y,Yan M,et al.Effects of riluzole on P2X7R expression in the spinal cord in rat model of neuropathic pain[J].Neurosci Lett，2016,618:127-133.

收稿2016-10-05;修回2016-11-15〗

(編輯：王靜)

Analgesic effect of analgecine on neuropathic pain in rats and the possible mechanisms

HuRui1,SunMengjie1,QinYing2,XiaoZhi2

(1.Graduate School,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Research Center for Medicine & Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To observe the analgesic effect of analgecine on expression changes of P2X7receptor in the lateral midbrain periaqueductal gray (lPAG) of rat model of neuropathic pain,and to examine its mechanisms.Methods Using adult male Sprague Dawley (SD) rats for the establishment of the sciatic nerve chronic constriction injury (CCI) model,followed by injections of different doses of analgecine around the injured sciatic nerve.Changes of the mechanical withdrawal threshold (MWT) values and the expression alterations of P2X7receptor in the lPAG of the experimental rats were examined.The effect of intra-lPAG injection of A-740003,a selective antagonist of P2X7receptor,on the analgesic effect of analgecine was also detected.Results The MWT values increased (P<0.001vscontrol and Sham-CCI) and the expressions of P2X7receptor in the lPAG were up-regulated dose-dependently after multiple injections of analgecine on the CCI rats (P<0.001vscontrol and Sham-CCI).Intra-lPAG injection of A-740003 partially but significantly reversed the analgesic effect of analgecine.Conclusion The injured-nerve local injections of analgecine can increase the MWT values of neuropathic pain rats,which is associated with the activation of P2X7receptors in the lPAG.

analgecine; neuropathic pain; midbrain periaqueductal gray; P2X7receptor

遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動資金資助項(xiàng)目(NO：F-799)。

肖智，男，博士，教授，研究方向：疼痛機(jī)制及調(diào)制，E-mail:xiaozhi1971@163.com。

R338.2

A

1000-2715(2016)06-0552-06