馮 揚(yáng)，胡曦尹，楊 城，付騰騰，單冰冰，黃厚今

(遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

靈芝孢子粉對亞急性鎘中毒大鼠腎臟的保護(hù)作用

馮 揚(yáng)，胡曦尹，楊 城，付騰騰，單冰冰，黃厚今

(遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 研究靈芝孢子粉(GLS)對亞急性鎘中毒大鼠腎臟的保護(hù)作用。方法 雄性SD大鼠50只，按體重分層后，采用隨機(jī)數(shù)字法分為5組，每組10只，即正常對照組(C組)、單獨(dú)染鎘組(Cd組)和3個(gè)給藥組(0.1、0.5、1.0 g/kg GLS+CdCl2，即GCdL組、GCdM組、GCdH組)。除C組外，其它組大鼠每天灌胃CdCl2(6.5 mg/kg)，3個(gè)給藥組每天灌胃靈芝孢子粉懸濁液，C組和Cd組灌等體積生理鹽水，持續(xù)42 d，定期稱重并觀察動物的一般表現(xiàn)。染毒結(jié)束后麻醉、取血、取腎臟；血生化檢測腎功能相關(guān)指標(biāo)；原子吸收光譜法(AAS)檢測腎組織及其線粒體、微粒體等亞細(xì)胞器中鎘的含量；腎臟病理HE染色切片觀察病理組織學(xué)改變。結(jié)果 與C組比較Cd組肌酐、尿素、尿酸、胱抑素-c均有不同程度升高，給予GLS干預(yù)后，各項(xiàng)指標(biāo)有不同程度降低，GCdM組、GCdH組肌酐變化與Cd組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予靈芝孢子粉干預(yù)后，鎘在各亞細(xì)胞器中有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HE染色顯示，單獨(dú)染鎘組腎組織細(xì)胞間質(zhì)充血嚴(yán)重，細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞邊界不清晰，腎小管管腔不明顯，核溶解情況嚴(yán)重，而給藥組以上情況均有不同程度改善，并且高劑量組效果優(yōu)于中劑量組。結(jié)論 靈芝孢子粉對亞急性鎘中毒大鼠腎臟有保護(hù)作用。

靈芝孢子粉；大鼠腎臟；氯化鎘；亞細(xì)胞器；保護(hù)

鎘(Cd)作為一種毒性極強(qiáng)的環(huán)境污染物，以各種無機(jī)化合物的形式廣泛分布于自然界中，在聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署提出的12種具有全球性意義的危險(xiǎn)化合物中，鎘被列為首位[1]。人接觸鎘會引起機(jī)體的毒性反應(yīng)[2]，長期接觸則會有腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。鎘的半衰期長(10～25年)，排泄率低，經(jīng)呼吸道和消化道進(jìn)入機(jī)體后容易在體內(nèi)蓄積，會對腎、肝、肺和血液系統(tǒng)產(chǎn)生一系列的損傷[5-6]。腎臟損傷是鎘對人體造成的主要危害[7]，研究表明：全球普通人群所患的慢性腎臟疾病中有7%是鎘所致[8]。

近年來，鎘中毒治療多使用螯合劑，而鎘與螯合劑會形成親脂性較大的螯合物，致使鎘在腦組織重新分布，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[9]。中藥防治鎘中毒具有時(shí)間短、療效好和毒副作用少等特點(diǎn)[10]，是防治鎘中毒的理想藥物來源。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉(GLS)對急性鎘中毒小鼠肝臟具有保護(hù)作用[11]，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究GLS對亞急性大鼠腎臟的保護(hù)作用，為開發(fā)鎘中毒的中藥產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 健康成年雄性SD大鼠50只，體重180～240 g，清潔級，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。動物室自然節(jié)律采光，室溫(22±2) ℃、濕度(60±5)%、普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分成5組：正常對照組(C組)、單獨(dú)染鎘組(Cd組)、GLS給藥組(0.1、0.5、1.0 g/kg GLS+CdCl2，即：GCdL、GCdM、GCdH)[12]，除C組外，各組大鼠每天灌胃CdCl2(6.5 mg/kg)[13]，1 h后GLS給藥組灌對應(yīng)的GLS劑量，C組和Cd組灌等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過程中觀察大鼠的一般表現(xiàn)并定期稱重，連續(xù)染毒42 d；染毒結(jié)束后禁食12 h，麻醉，腹腔主動脈取血并分離血清用全自動血生化分析儀檢測尿素、尿酸、肌酐等腎功能指標(biāo)，取腎臟。

1.2 藥品、試劑與儀器 GLS(靈芝孢子粉)由貴州吉仁堂藥片廠提供，氯化鎘(CdCl2)由美國sigma公司提供(純度99.999%)，蘇木精-伊紅(HE)染色液(湖北百奧斯生物科技有限公司)；甲醛溶液(成都科龍化工試劑廠)；濃HNO3由重慶川江化學(xué)試劑廠提供，蔗糖、PBS購于Sangon生物；Varian/AA240石墨爐原子吸收儀(美國瓦里安有限公司)；Fx-200電子分析天平(日本A&D公司)；貝克曼庫爾特AU5800系列全自動生化分析儀(美國Backman Coulter公司)。

1.3 AAS檢測腎組織及各細(xì)胞器Cd含量 稱取50 mg腎臟組織加入1 mL 0.25 mol/L蔗糖溶液，玻璃勻漿器勻漿，用差速離心機(jī)分離組織勻漿液(kindey)中各細(xì)胞器。離心(600×g，10 min)取上清液，上清液離心(10 000×g，10 min)沉淀為線粒體(Mit)，取上清離心(20 000×g，30 min)沉淀為微粒體(Mic)，最終上清液為細(xì)胞質(zhì)(Cyt)。分離出的各細(xì)胞亞細(xì)胞器和組織勻漿液分別加入1.5 mL濃硝酸消化，過夜。最后用0.5%稀硝酸定容，上機(jī)檢測。測定條件：波長228.8 nm，狹縫0.5 nm，鎘燈背景校正，濃度、峰高定量，燈電流 14.0 mA，進(jìn)樣體積20.0 mL，最大吸光度0.7 A，氬氣環(huán)境：10 mL、1.1 mg/L溶液吸光度約0.2 Abs，灰化溫度300 ℃，原子化溫度1 800 ℃。

1.4 腎組織病理學(xué)觀察 連續(xù)染毒42 d后，各組取大鼠4只，腹腔麻醉后迅速打開腹腔，腹腔主動脈取血，取腎臟，剔除筋膜，放于10%的甲醛溶液中固定，然后脫水、石蠟包埋、5 μm切片和HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 染毒期間，正常對照組大鼠活動、飲水和飲食均正常。隨著染毒時(shí)間的延長，各劑量組大鼠出現(xiàn)對刺激敏感，毛發(fā)雜亂，飲食量減少等表現(xiàn)。染毒26 d時(shí)，各劑量組大鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉；染毒34 d時(shí)，各劑量大鼠有口鼻部發(fā)紅，口腔分泌物增加等表現(xiàn)。到染毒結(jié)束時(shí)，Cd組和GCdL組大鼠均出現(xiàn)口鼻部發(fā)紅的表現(xiàn)。

2.2 腎功能血清學(xué)變化 與對照組比較，Cd組的尿酸、尿素、胱抑素-c、肌酐明顯升高，有GLS干預(yù)的劑量組與Cd組比較，尿酸、尿素、胱抑素-c、肌酐含量均有不同程度降低。其中Cd組、GCdL組肌酐變化與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GCdM組、GCdH組肌酐變化與Cd組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

組別尿素尿酸胱抑素-c肌酐C670±0971354±4234111±0354020±421Cd755±0881566±5728135±0484840±422?GCdL753±0581514±4293132±0674660±434?GCdM737±0651414±2701122±0554340±241#GCdH680±0371372±4293119±0594200±122#F1610022401764550P0211092209480009

*：與C組比較，P<0.05；#：與Cd組比較，P<0.05。

2.3 腎臟組織及其各亞細(xì)胞Cd的含量分布 給予靈芝孢子粉的大鼠腎臟中，鎘大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中，而線粒體和微粒體的鎘含量較少，單獨(dú)染鎘組腎組織、線粒體、微粒體鎘含量均比GCdL、GCdM、GCdH組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在細(xì)胞質(zhì)中，GCdM、GCdH組鎘含量較單獨(dú)染鎘組和GCdL組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

組別KidneyMitMicCytCd5203±490581±087227±0132224±434GCdL3984±737?476±079164±039?1949±282GCdM2858±382?#407±050?112±024?#1363±161?#GCdH2467±237?#340±136?#090±008?#1126±190?#

*：與Cd組比較，P<0.05；#：與GCdL組比較，P<0.05。

2.4 腎組織的病理組織學(xué)改變 由圖1可見，正常組腎臟組織細(xì)胞漿分布均勻，腎小管管腔明顯，細(xì)胞排列緊密，有規(guī)則，細(xì)胞邊界清晰，無間質(zhì)充血。與正常對照組比較，單獨(dú)染鎘組腎組織間質(zhì)充血明顯，腎小管形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞邊界不清晰，細(xì)胞水腫明顯。靈芝孢子粉干預(yù)處理明顯改善腎臟損傷，腎組織間質(zhì)充血減輕，細(xì)胞水腫減輕，未見核固縮、核溶解現(xiàn)象，細(xì)胞邊界逐漸清晰，且靈芝孢子粉高劑量組效果較低劑量組明顯。

A：對照組；B：單獨(dú)染鎘組；C：GCdM組；D：GCdH組。Cd組與對照組比較腎小管形態(tài)明顯不規(guī)則，管腔腔隙縮小，細(xì)胞水腫明顯，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核溶解；給藥組與Cd組比較腎小管損傷均有不同程度改善(如圖箭頭所示)。圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)(HE，×400)

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)和工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染備受關(guān)注，人們可從環(huán)境和食物中攝入鎘在機(jī)體蓄積，從而導(dǎo)致急慢性鎘中毒[14]。目前，尚無較好的拮抗鎘中毒的手段，當(dāng)發(fā)生急性食入性鎘中毒時(shí)，主要給予大量補(bǔ)液、注射阿托品止吐和消除腹痛等對癥治療，而金屬螯合劑，如依地酸二鈣鈉非但不能拮抗鎘毒性，甚至有加重毒作用的可能。而研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物如蒲公英黃酮和大蒜混合物對拮抗鎘中毒有一定效果的[15]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找對抗鎘毒性的解毒劑有重要意義。

已有研究證實(shí)：靈芝對順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷、阿霉素誘導(dǎo)的腎臟損傷、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的腎臟損傷均發(fā)現(xiàn)不同程度的保護(hù)作用[16-18]；臨床研究也表明：靈芝制劑可以作為治療藥或輔助治療藥[19]。靈芝孢子粉的藥效在多方面超過母體靈芝[20]，它除具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)外，還含有比靈芝更豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質(zhì)、酶類、硒元素等特殊成份[21]，由此推測，靈芝孢子粉對鎘所致的亞急性腎臟損傷可能有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過對靈芝孢子粉的研究，為以后治療亞急性鎘中毒尋求新的治療藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)染鎘組大鼠的尿素、尿酸、胱抑素-c、肌酐含量明顯升高。肌酐是腎臟排泄產(chǎn)物，由肌肉中肌酸分解產(chǎn)生，其升高的原因可能是氯化鎘損傷腎小球，使腎小球?yàn)V過率下降，肌酐排泄受影響，致使血肌酐含量升高；由于毒物損傷腎小管，使腎小管分泌功能受到抑制，致使血尿酸升高；隨著靈芝孢子粉的劑量增加，靈芝孢子粉干預(yù)組大鼠血清肌酐含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明靈芝孢子粉對亞急性鎘中毒大鼠腎臟有保護(hù)作用。

鎘在亞細(xì)胞水平上的靶器官主要是線粒體、微粒體等亞細(xì)胞器，如果藥物能有效阻止或減少鎘離子進(jìn)入這些細(xì)胞器，就可以將鎘與靶細(xì)胞器隔離，達(dá)到阻止鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而達(dá)到減小毒物毒作用的目的[22]。由本文可知，鎘在細(xì)胞質(zhì)中含量明顯高于線粒體和微粒體；給予靈芝孢子粉干預(yù)的大鼠較單獨(dú)染鎘組大鼠線粒體和微粒體的鎘含量低(P<0.05)。說明靈芝孢子粉能有效的降低各亞細(xì)胞器內(nèi)的鎘含量，從而減小鎘的毒作用，達(dá)到對亞急性鎘中毒大鼠腎臟保護(hù)的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究表明靈芝孢子粉具有拮抗亞急性鎘中毒所致的的腎臟毒性作用，減少鎘在腎臟和各細(xì)胞亞器中的蓄積從而降低鎘的毒性作用，能夠?yàn)殒k中毒的藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

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收稿2016-10-10;修回2016-11-12〗

(編輯：王靜)

Protective effects ofGanodermalucidumspore on subacute cadmium nephrotoxicity in male rat

FengYang,HuXiyin,YangCheng,FuTengteng,ShanBingbing,HuangHoujin

(Department of Toxicology,School of Public Health，Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the protection of Ganodermalucidum spore (GLS) on subacute cadmium-induced kidney injuryin male rats.Methods 50 male SD rats were randomly assigned to control group (C,saline + saline,by gavage),Cd group [Cd,CdCl2(6.5 mg/kg) + saline,by gavage],and 3 treatment groups:GCdL[CdCl2(6.5 mg/kg) + GLS (0.1 g/kg),by gavage],GCdM[CdCl2(6.5 mg/kg)+GLS(0.5 g/kg),by gavage],GCdH[CdCl2(6.5 mg/kg)+GLS(1.0 g/kg),by gavage],10 in each group,all were treated for 42 days.Rats were weighed regularly,and observed for normal behavior.At the completion of the experiment,rats were sacrificed with anaesthesia,and blood was sampled fromabdominal aorta forbiochemical tests,and kidneys were stored frozen.The cadmium conten sink idney and subcellular components were tested by atomic-absorption spectrophotometer,and kidneys were examined by pathological sections.Results Compared with Cd group,creatinine,urea,uric acid,serum cystatin-c were reduced in treatment group,and creatinine in GCdM,GCdHwere significantly reduced (P<0.05).The cadmium content of subcellular was reduced after giving GLS (P<0.05).Kidney H&E staining showed that kidneys from Cd group rats showed more engorgement of the interstitium,tubular dilatation,tubular atrophy,karyolysis of tubular epithelial cells than the kidneys of GLS treated rats,and the treatment effect of high dose was much better than medium dose.Conclusion GLS has protective effects against Cd-induced chronic kidney injury in rats.

Ganodermalucidumspore;rat kidney;CdCl2;subcellular organelle;protection

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科教200904)。

黃厚今，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：營養(yǎng)毒理學(xué)，E-mail:1026553087@qq.com。

R114

A

1000-2715(2016)06-0573-04