梁世霞，劉正蕓，余麗梅，劉 云，郭 靜，賈智誠(chéng)，拓軍雄，劉 杰

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室/貴州省教育部基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099;4.榆林市衛(wèi)生學(xué)校 基礎(chǔ)教研室，陜西 榆林 719000)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

六神丸和砷化合物對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞增殖的影響

梁世霞1,4，劉正蕓1，余麗梅2，劉 云3，郭 靜4，賈智誠(chéng)4，拓軍雄4，劉 杰1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室/貴州省教育部基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099;4.榆林市衛(wèi)生學(xué)校 基礎(chǔ)教研室，陜西 榆林 719000)

目的 中藥六神丸(LSW)含雄黃(As4S4)。近年研究表明砷化合物對(duì)血液腫瘤有顯著的抑制作用，但其對(duì)實(shí)體瘤的作用報(bào)道少。故我們就六神丸和砷化合物[Na2HAsO4(As5+)、NaAsO2(As3+)、 As2O3、As4S4和As2S2]對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞的抗腫瘤作用進(jìn)行了研究。方法 采用MTS法檢測(cè)六神丸、雄黃及其他含砷化合物對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞的殺滅作用，通過(guò)原子吸收光譜測(cè)定各砷化合物中砷(As)的溶出度；流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響；熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果 六神丸中As的溶出度高于雄黃和As2S2,但低于亞砷酸鈉(As3+)、砷酸鈉(As5+)和As2O3。六神丸對(duì)Hep3B有較好的抑制增殖和殺滅作用，其作用僅次于亞砷酸鈉。六神丸可誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與降低Bcl-2及Bcl-w的表達(dá)有關(guān)，并降低ABCG2、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-9的表達(dá)。但六神丸對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。結(jié)論 六神丸通過(guò)多途徑對(duì)肝癌Hep3B細(xì)胞具有明顯的抗增殖作用。

六神丸；抗腫瘤；Hep3B細(xì)胞；砷化合物；凋亡

六神丸(LSW)是治療口舌糜爛、咽喉腫痛、牙痛、流行性腮腺炎等清熱解毒的良方，含有13%的雄黃(As4S4)[1]。六神丸在體內(nèi)對(duì)白血病、食管癌、胃癌等療效顯著[2]，在體外對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞[3]、NB4細(xì)胞[4]、人肝癌BEL7402細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞[5]和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[6]等均有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。六神丸對(duì)小鼠白血病模型(L7212)[7]、H22肝癌荷瘤鼠[8-9]和S180肉瘤荷瘤鼠[10-11]有明顯抑制作用，可降低其死亡率。六神丸組方中有雄黃，其抗腫瘤作用是否與As的溶出有關(guān)，目前還不清楚，其體外對(duì)Hep3B細(xì)胞的作用及機(jī)制也未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)法觀察六神丸及其他含砷化合物對(duì)Hep3B細(xì)胞的作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 六神丸(LSW)、雄黃購(gòu)自雷允上藥物有限公司；砷酸鈉(Na2HAsO4，As5+)、亞砷酸鈉(NaAsO2，As3+)、順鉑(Pt)、三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)、和二硫化二砷(As2S2)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。所有試劑均為分析純等級(jí)。人肝癌細(xì)胞Hep3B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命研究院。

1.2 方法

1.2.1 MTS法檢測(cè)細(xì)胞毒性 Hep3B細(xì)胞用含15%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。Hep3B細(xì)胞1×105/孔(90 μL)接種于96孔板后，分別加入10 μL不同濃度 (0、0.03、0.1、0.3、1、3和10 mg/mL)的不同試藥(As5+、As3+、Pt、ATO、As4S4和As2S2)，培養(yǎng)48 h后加入MTS液作用2.5 h，酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算抑制率。

1.2.2 原子吸收法測(cè)砷溶解度 用無(wú)血清培養(yǎng)基溶解各含砷藥物(24 h)，取上清液稀釋1 000倍后上機(jī)檢測(cè)As濃度，用上清液中的As濃度及各藥物的含砷量計(jì)算藥物的砷溶解度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期及其凋亡率 細(xì)胞接種12 h后用含0.5% FBS培養(yǎng)基處理，使其同步化，24 h后給藥作用12 h，收集細(xì)胞，PBS洗3～5次。用75%酒精固定細(xì)胞，清洗，染色30 min，檢測(cè)細(xì)胞周期。Annexin V-FITC/ PI雙染細(xì)胞，暗室室溫下孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 RT-PCR術(shù)檢測(cè)抗腫瘤作用相關(guān)基因mRNA水平變化 細(xì)胞治療24 h后用Trizol收集細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA用熒光定量PCR擴(kuò)增，所得Ct和同一標(biāo)本的看家基因進(jìn)行效正，設(shè)對(duì)照組為100%進(jìn)行比較，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

基因名稱GeneBank#正向引物反向引物ABCG2NM＿004827CGGGTGACTCATCCCAACATCTTAACCAAAGGCTCAGGATCTCABcl-2NM＿000633CATGTGTGTGGAGAGCGTCAAGCCGGTTCAGGTACTCAGTCABcl-wU58747GGACAAGTGCAGGAGTGGATGTCCTCACTGATGCCCAGTTGAPDHNM＿002046CCTCCCGCTTCGCTCTCTCTGGCGACGCAAAAGAAGAMMP-9NM＿004994GGACGATGCCTGCAACGTGTACTTCCCATCCTTGAACAAATACAGVEGFX62568AACACAGACTCGCGTTGCAAACCGCCTCGGCTTGTCA

2 結(jié)果

2.1 藥物抑制細(xì)胞增殖的作用 MTS法檢測(cè)細(xì)胞毒性(見(jiàn)圖1)，六神丸(LSW)和三價(jià)砷(As3+)作用較強(qiáng)，且隨濃度增大作用增強(qiáng)。六神丸的IC50約為0.1 mg/mL,其他砷化物的IC50分別是雄黃7.6 mg/mL(LSW的76倍),三氧化二砷(ATO)0.5 mg/mL(LSW的5倍)，As2S22.9 mg/mL(LSW的29倍)，As5+0.8 mg/mL(LSW的8倍)。六神丸體外抑制和殺滅Hep3B細(xì)胞作用與順鉑相當(dāng)，甚至略強(qiáng)于順鉑(IC50為0.2 mg/mL)。

圖為六神丸和不同砷化合物對(duì)Hep3B增殖的抑制作用的量效關(guān)系，結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均，以IC50來(lái)評(píng)價(jià)各藥的相對(duì)強(qiáng)度。As5+：砷酸鈉；As3+：亞砷酸鈉；Pt：順鉑；LSW：六神丸；ATO：三氧化二砷；As4S4：四硫化四砷，雄黃；As2S2：二硫化二砷。 圖1 六神丸和相關(guān)砷化合物對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 不同含砷化合物中砷的溶解度 表2結(jié)果表明，不同含砷藥物的砷溶解度差異較大。有報(bào)道稱中藥復(fù)方中的其他成分抑制As的溶出而降低其毒性[12]，我們的實(shí)驗(yàn)證明六神丸中雄黃的As溶解度是增加的，表明六神丸組分的相互作用可增加As的溶出。

表2 六神丸及相關(guān)砷化物的As溶解度差異

藥物溶解度(%)LSW174As4S416As2S230As3+885As5+1047ATO541

2.3 六神丸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用 六神丸各濃度組均有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且隨著濃度增加而增強(qiáng)，0.1和0.3 mg/mL濃度與對(duì)照之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

組別六神丸濃度(mg/mL)凋亡細(xì)胞(%)死亡細(xì)胞(%)正常對(duì)照組0571±1315±13低濃度六神丸00386±4412±02中濃度六神丸01100±10?23±04高濃度六神丸03154±34?25±02

*表示與正常對(duì)照組比較，P<0.05。

2.4 六神丸對(duì)細(xì)胞周期的影響 六神丸對(duì)Hep3B細(xì)胞的細(xì)胞周期有輕微的阻滯作用，但與對(duì)照組比的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表4)。

組別六神丸濃度(mg/mL)G0～G1SG2～M正常對(duì)照組0479±33361±74159±41低濃度六神丸003496±27311±65193±46中濃度六神丸01485±30289±74226±44高濃度六神丸03504±38314±88154±47

2.5 六神丸對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 六神丸1.0和10 mg/mL濃度明顯降低抑制凋亡基因Bcl-2和Bcl-wmRNA的表達(dá)(P<0.05，見(jiàn)表5)，此結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果相互印證。

組別六神丸濃度(mg/mL)抑制凋亡基因Bcl-2Bcl-w正常對(duì)照組0100±61100±700 低濃度六神丸01100±12050±300中濃度六神丸10 76±22?30±82?高濃度六神丸100 56±31?29±95?

*表示與正常對(duì)照組比較，P<0.05。

2.6 六神丸對(duì)其他相關(guān)基因表達(dá)的影響 六神丸明顯降低與耐藥相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族G亞家族第2號(hào)(ABCG2)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA的表達(dá)，同時(shí)抑制與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因(MMP-9)的表達(dá)(P<0.05，見(jiàn)表6)，提示六神丸抗肝癌的作用可能是多層次多角度的網(wǎng)絡(luò)過(guò)程。

組別六神丸濃度(mg/mL)ABCG2VEGFMMP-9正常對(duì)照組0100±14．0100±29．0100±11．0低濃度六神丸01 41±14．0? 52±14．067±45中濃度六神丸10 39±15? 39±65? 41±22?高濃度六神丸100 55±37? 30±11．0? 35±35?

*表示與正常對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

中國(guó)是肝病大國(guó)，在我國(guó)，被稱為“癌中之王”的肝癌發(fā)病率較高，且不易被早期診斷，惡性度高，易轉(zhuǎn)移，治療難度大。近年來(lái)，在肝癌治療及藥物的作用機(jī)制方面進(jìn)行了大量研究，并取得一定成績(jī)。六神丸是我國(guó)四大名藥之一，臨床上用其治療多種疾病[2]，其在體內(nèi)外均有較好的抗腫瘤作用[2-11]，但其對(duì)肝癌的治療鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，六神丸通過(guò)不同的途徑發(fā)揮抗肝癌細(xì)胞的作用。

實(shí)驗(yàn)表明，六神丸和砷化合物均有殺滅Hep3B肝癌細(xì)胞的活性，但六神丸抑制Hep3B肝癌細(xì)胞增殖的IC50值明顯小于雄黃、As2O3、As2S2和As5+。我們以前的實(shí)驗(yàn)顯示六神丸或雄黃不同于環(huán)境中含砷化合物，其安全系數(shù)較大，為進(jìn)一步開發(fā)其抗腫瘤作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[13-19]，也未發(fā)現(xiàn)六神丸復(fù)方減少雄黃中砷的釋放和在組織中的蓄積[13]。這次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明六神丸中砷的溶出明顯高于雄黃中砷的溶出量，提示組方中其他藥物可能促進(jìn)砷的溶出。

誘導(dǎo)凋亡是抗腫瘤藥物的一個(gè)重要機(jī)制，報(bào)道表明六神丸誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞凋亡與其上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)有關(guān)[20]，其含藥血清誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡，系上調(diào)Caspase-3的表達(dá)[21]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，六神丸誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)可明顯下調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2、Bcl-wmRNA的表達(dá)。

克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性是抗腫瘤治療研究的一個(gè)難題。報(bào)道指出六神丸可通過(guò)影響P170和TopoⅡβ的表達(dá)而殺滅耐藥的白血病細(xì)胞[22]，細(xì)胞外排蛋白ABCG2把化療藥物排出細(xì)胞外而產(chǎn)生耐藥性，且這種耐藥性在多種化療藥物之間交叉存在[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，六神丸可以明顯降低ABCG2的表達(dá)，說(shuō)明六神丸應(yīng)用于治療腫瘤時(shí)，其可能通過(guò)降低與藥物外排相關(guān)蛋白的表達(dá)而產(chǎn)生較理想的遠(yuǎn)期療效。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展需要新生血管的形成為其提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分，在血管生成的眾多生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)中，VEGF是目前已知作用最強(qiáng)、專屬性最高的促血管生長(zhǎng)因子。有報(bào)道表明，六神丸明顯降低S180肉瘤模型小鼠VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(β-FGF)的表達(dá)而降低微血管密度，協(xié)同阻止腫瘤組織血管生成[24-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小劑量六神丸即可明顯降低VEGF的表達(dá)，提示六神丸也可以通過(guò)阻止新生血管的生成而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

癌腫的局部擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移是肝細(xì)胞癌致死的主要原因之一?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)可降解基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞容易侵襲轉(zhuǎn)移。六神丸含藥血清能下調(diào)β-FGF和MMP-9的表達(dá)，從而減少人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，六神丸可以明顯下調(diào)MMP-9基因表達(dá)，提示六神丸可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，機(jī)制與其抑制MMP-9蛋白酶對(duì)基質(zhì)的降解，降低血管通透性有關(guān)。

中藥復(fù)方抗腫瘤作用是通過(guò)多種途徑、多個(gè)靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的，六神丸中的雄黃為君藥，蟾酥為臣藥，其他成分為佐藥和使藥，各成分之間相互協(xié)同而發(fā)揮更好的抗腫瘤作用，這正是中藥復(fù)方的作用特點(diǎn)。

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[收稿2016-10-02;修回2016-11-01]

(編輯：王靜)

Effects of Liu-Shen-Wan and arsenic compounds on hepatoma Hep3B cells

LiangShixia1,4,LiuZhengyun1,YuLimei2,LiuYun3,GuoJing4,JiaZhicheng4,TuoJunxiong4,LiuJie1

(1.Key Lab for Basic Pharmacology of Ministry of Education,Department of Pharmacology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Key Lab of Cell Engineering,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 4.Department of General Studies,School of Public Health of Yulin City,Yulin Shanxi 719000,China)

Objective Arsenic (As) is effective for blood malignancies but little is known about its effects on solid tumors.This study aimed to examine the effect of As-containing Liu-Shen-Wan (LSW) and As compounds [Na2HAsO4(As5+),NaAsO2(As3+),As2O3,As4S4and As2S2] on the proliferation of the human hepatoma Hep3B cells and the potential mechanisms.Methods Cultured Hep3B cells were treated with LSW and arsenic compounds for 6-48 h.The cytotoxicity,cellular arsenic accumulation,cell cycle regulation,and the expression of genes related to apoptosis were examined.Results The release of As from LSW was higher than As4S4and As2S2,but was much lower than NaAsO2,Na2HAsO4,and As2O3.LSW was effective in inhibition of Hep3B cell proliferation,an effect secondary to NaAsO2,but stronger than As4S4.LSW induced apoptosis of the cells,but had no major effects on cell cycles.LSW down-regulated the expression of Bcl-2 and Bcl-w,and inhibited the gene expression of breast cancer resistance protein (BCRP/ABGC2),vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metallopeptidase 9 (MMP-9).Conclusion Arsenic release depends on chemical forms of arsenicals.LSW showed antitumor effects towards hepatoma Hep3B cells,probably though apoptosis and tumor growth-related gene expressions.

Liu-Shen-Wan; antitumor; Hep3B cells; arsenic compounds; apoptosis

貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目(NO:TZJF 2010-5和2013-03)；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(NO:黔教合KY字[2014]212)。

劉杰，男，教授，研究方向：藥理毒理學(xué)，E-mail:jieliu@zmc.edu.cn。

R966

A

1000-2715(2016)06-0558-05