唐春梅， 朱杰寧， 朱文思1, ， 林秋雄， 胡志琴， 符永恒， 張夢珍， 鄧春玉，譚虹虹， 吳書林， 單志新△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州510515； 2廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院， 廣東 廣州 510080)

·論 著·

MEF2C介導microRNA-214發(fā)揮抑制心肌細胞肥大的作用*

唐春梅1,2， 朱杰寧2， 朱文思1, 2， 林秋雄2， 胡志琴1,2， 符永恒2， 張夢珍2， 鄧春玉2，譚虹虹2， 吳書林2， 單志新2△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州510515；2廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院， 廣東 廣州 510080)

目的： 研究微小RNA-214(miR-214)對心肌細胞肥大的調控作用及其可能的作用靶基因。方法: 建立血管緊張素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)誘導的C57BL/6乳小鼠心室肌細胞肥大模型；雙螢光素酶報告基因實驗檢測miR-214與潛在靶基因MEF2C3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)的結合作用；實時熒光定量PCR (RT-qPCR) 和Western blot 法分別檢測MEF2C及肥厚標志物的mRNA和蛋白表達水平。結果: 心肌肥厚標志物ANP、ACTA1和β-MHC，以及miR-214的表達在Ang-II誘導肥大的小鼠心肌細胞中顯著增強；雙螢光素酶報告基因實驗提示miR-214與MEF2C3’UTR相互作用，證實miR-214可在轉錄水平抑制MEF2C的表達，MEF2C蛋白水平在肥大的心肌細胞中顯著上調；過表達miR-214及沉默MEF2C均能一致性地抑制Ang-Ⅱ誘導的心肌細胞中肥大標志物的表達。 結論:MEF2C是miR-214的靶基因，并介導了miR-214發(fā)揮抑制心肌細胞肥大的作用。

心肌肥厚； 微小RNA-214； MEF2C； 心肌細胞

心肌肥厚是心肌重構的重要組成部分，是心血管疾病最為常見的并發(fā)癥之一。心肌肥厚是心肌對包括機械刺激、激素、細胞因子、生長因子或壓力負荷增加等刺激作用下的代償性適應。心肌肥厚時心肌標志蛋白表達水平升高，發(fā)生心肌細胞肥大，同時伴隨有心肌細胞外間質增多、心臟重量增加，還伴有心肌成纖維細胞的增殖與轉化以及心肌間質纖維化等病理改變，病理性心肌肥厚最終將導致心肌病和心衰[1]。盡管人們開展心肌肥厚的相關研究已有幾十年，但對于心肌肥大發(fā)生和維持的確切機制仍不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛存在于動植物中，是一類內(nèi)源性的18～25個堿基的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補配對，與靶信使RNA(mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)序列相互識別，抑制相應 mRNAs的翻譯或降解特異mRNAs,其主要在轉錄后水平調控基因的表達[2-3]。越來越多的研究表明，心肌肥厚時miRNAs表達譜發(fā)生顯著改變，一些miRNAs參與了心肌肥厚的病理過程，并發(fā)揮著重要作用[4-7]。已有研究顯示[8-11]，miR-1、miR-208a、miR-195和miR-199a-5p在心肌肥厚時均上調表達，過表達miR-208a或miR-195的轉基因小鼠，給予其促肥厚處理后，其心臟病理情況更為明顯,給予心肌細胞過表達miR-1或過表達miR-199a-5p處理后，心肌細胞也發(fā)生明顯的肥大。與之相反，心肌肥厚時，miR-150和miR-181b表達顯著下調，且對心肌細胞給予過表達miR-150或 miR-181b處理之后，心肌細胞表面積會明顯減小[10]。心肌肥厚時，miR-214的表達也發(fā)生顯著改變[12]，提示miR-214可能參與了心肌肥厚的過程。然而，miR-214在心肌肥厚中的的作用機制目前仍不明確，本研究旨在探討miR-214調控心肌細胞肥大的分子機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoR I、轉染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol、逆轉錄試劑盒和4×SDS loa-ding buffer(Invitrogen)；2×SYBR Green Mix和RNase free water(TaKaRa)；miR-214 mimic和MEF2CsiRNA(廣州銳博)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(碧云天)；GAPDH Ⅰ抗、 ACTA1 Ⅰ抗和Ⅱ抗(Protein Technology)；抗ANP抗體(Abcam)；抗β-MHC 抗體(Sigma)；蛋白Marker(Fermentas)； PVDF膜(Whatman)； ECL發(fā)光液(Bioword)；DMEM/F12細胞培養(yǎng)基(HyClone)；特級澳洲胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶粉末(廣州威佳科技有限公司)。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1 乳小鼠心肌細胞原代分離培養(yǎng)及處理 取出生1～3 d SPF級C57BL/6乳小鼠心臟，以0.25%胰蛋白酶消化法原代分離細胞。乳小鼠心室肌細胞(neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs)與成纖維細胞由于貼壁速度不同而得以分離，收集上清中心肌細胞，將其接種于提前用1 %明膠包被過的12孔板中，用含有10 %胎牛血清及1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，更換1次完全培養(yǎng)基至穩(wěn)定培養(yǎng)48 h。采用10-8mol/L血管緊張素-Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)誘導小鼠心肌細胞發(fā)生肥大。分別將50 nmol/L scramble對照、miR-214 mimic和MEF2CsiRNA轉染小鼠心肌細胞，24 h后結束實驗。

2.2 FITC-鬼筆環(huán)肽(FITC-phallodin)染色 將NMVCs鋪在預先放置了無菌圓形玻片的12孔板中。穩(wěn)定生長后吸掉培養(yǎng)基，用PBS漂洗2次，加入500 μL的4%的多聚甲醛溶液固定，再用2 g/L的甘氨酸溶液中和多聚甲醛，搖床孵育2次，每次5 min。將10 mg/L的FITC標記的鬼筆環(huán)肽染料37 ℃孵育40 min，用1×PBS漂洗2次，再行Hoechst 33342反應液，避光37 ℃孵育40 min。將細胞爬片倒扣置另一個滴有30 μL防熒光淬滅封片劑的載玻片上，在倒置熒光顯微鏡下觀察F-actin被染色后顯示出細胞輪廓。

2.3 實時熒光定量PCR檢測肥厚相關基因、MEF2C以及miR-214表達 用TRIzol試劑提取心肌細胞總RNA。取2.0 μg總RNA，加入5×的逆轉錄試劑4 μL(逆轉錄試劑盒)，用oligo (dT)15和random primers逆轉錄出cDNA用于檢測編碼基因mRNA水平。取1.0 μg總RNA，用miR-214特異的RT引物逆轉錄出cDNA用于檢測miR-214水平。分別用GAPDH和U6作為檢測編碼基因和miR-214表達水平的內(nèi)參照。在ViiATM7 Quantitative PCR System(Applied Biosystems)進行PCR反應和結果分析。以2-ΔΔCt法計算目標基因和miR-214的相對表達水平。本文所用PCR引物序列見表1。

2.4 Western blot 法檢測蛋白水平 收集處理后的心肌細胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清進行蛋白定量后分裝，加入4×上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白變性，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。用PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別用相應的抗體anti-ANP (1∶5 000)和anti-β-MHC(1∶1 000)、anti-ACTA1(1∶5 000)、anti-MEF2C(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加II抗(1∶5 000)4 ℃孵育2 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH(1∶5 000)為內(nèi)參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse.

2.5 雙螢光素酶報告實驗驗證miR-214與MEF2C3’UTR的結合作用 參照我們已報道方法[13]分別構建包含miR-214潛在結合序列的MEF2C3’UTR重組螢光素酶報告質粒pGL3-MEF2C-bs及包含結合序列突變的重組質粒pGL3-MEF2C-bs-MUT。利用HEK293細胞，將HEK293細胞(細胞密度約為每孔1×105)轉染200 ng重組螢光素酶報告質粒，50 nmol/L miR-214 mimic以及10 ng pRL-TK(表達海腎螢光素酶的內(nèi)參照質粒)。轉染后24 h，測定螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase, FL)及海腎螢光素酶(Renillaluciferase, RL)強度，兩種熒光強度比值(FL/RL)變化可反映miR-214與MEF2C3’UTR結合的能力。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)并用SNK-q檢驗進行各組間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-214 在肥大的心肌細胞中表達增強

FITC-phallodin染色結果顯示10-8mol/L Ang-Ⅱ處理48 h后的NMVCs 發(fā)生顯著的心肌細胞肥大。與空白組相比，Ang-Ⅱ處理的NMVCs中肥厚標志物ANP、ACTA1及β-MHC的mRNA表達和蛋白表達顯著增強。上述結果表明Ang-Ⅱ能夠成功誘導NMVCs出現(xiàn)肥大表型。同時， RT-qPCR結果顯示miR-214在發(fā)生肥大的NMVCs中表達亦顯著增加，見圖1。

2MEF2C是miR-214 作用靶基因的驗證

基于miRDB(www.mirdb.org)以及TargetScan-Vert (www.targetscan.org)的序列分析提示，MEF2C3’UTR的4 372～4 378堿基可能是miR-214的結合位點。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示miR-214可特異地結合到MEF2C3’UTR的4 372～4 378位點，而突變結合區(qū)序列后，miR-214就不能與MEF2C3’UTR結合。RT-qPCR 和Western blot 法檢測結果顯示，MEF2C在Ang-II誘導的肥大NMVCs中表達明顯增強，而miR-214 mimic和MEF2CsiRNA能一致性地在mRNA和蛋白水平抑制NMVCs中MEF2C表達，見圖2。

3 過表達miR-214及沉默MEF2C可有效抑制心肌細胞肥大基因的表達

為從功能上鑒定過表達miR-214與抑制MEF2C對心肌細胞肥大的影響，分別將50 nmol/L miR-214 mimic和MEF2CsiRNA轉染入Ang-II誘導的NMVCs中。Western blot結果顯示，miR-214 mimic和MEF2CsiRNA能一致性地抑制Ang-II誘導NMVCs中ACTA1和β-MHC的表達增加，見圖3。

Figure 1.miR-214 was increased in the myocardium of a mouse model of hypertrophy induced by Ang-II infusion. A: FITC-phalloidin staining assay; B: the mRNA expression of hypertrophy-related genes was determined by RT-qPCR; C: the protein expression of ANP, ACTA1 and β-MHC was determined by Western blot; D: the expression of miR-214 was assessed by RT-qPCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank group.

圖1 miR-214在Ang-II誘導的肥厚小鼠心肌中表達增強

討 論

近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-214在小鼠心肌缺血再灌注時的表達顯著升高；而miR-214敲除小鼠在缺血再灌注損傷7 d 后發(fā)生心肌肥厚和心肌纖維化程度明顯加重。機制研究證實，miR-214可通過抑制鈉鈣交換體1(Na+/Ca2+exchanger 1，Ncx1)而抑制Ca2+通道功能，從而抑制缺血損傷所致的Ca2+超載及細胞死亡，進而有效抑制小鼠缺血性心肌損傷，發(fā)揮心肌保護作用[14]。miR-214在H2O2處理的心肌細胞中亦表達上調，而PTEN是miR-214的作用靶基因，并介導miR-214發(fā)揮抗H2O2所致的心肌細胞凋亡作用[15]。

既往研究顯示miR-214也參與了心肌肥厚的病理過程。在小鼠心肌細胞中過表達miR-214，能顯著上調心肌肥厚標志物ANP、ACTA1及β-MHC表達，而EZH2可能介導了miR-214的促心肌肥厚作用；在miR-214的轉基因小鼠心肌中ANP、ACTA1及β-MHC表達上調，并且抑制miR-214表達能有效下調橫向主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)所致的ANP、ACTA1及β-MHC表達增加[16-17]。

本文中，我們證實miR-214在Ang-Ⅱ誘導肥大的小鼠心肌細胞中表達升高。雙螢光素酶報告基因實驗提示miR-214可與MEF2C 3’UTR特異性結合。而檢測過表達miR-214的NMVCs中MEF2C水平發(fā)現(xiàn)，miR-214可在轉錄水平抑制MEF2C表達。進一步的功能性研究表明，miR-214和MEF2CsiRNA可一致性地抑制Ang-Ⅱ誘導的NMVCs中心肌肥大相關ACTA1和β-MHC表達。因此，上述結果證實MEF2C是miR-214的靶基因，并介導miR-214發(fā)揮抑制心肌肥大的作用。

肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)家族蛋白是一類具有調節(jié)功能的蛋白,包括MEF2A、2B、2C和2D[18-19]。MEF2C在心臟中高表達，作為心臟特異的轉錄因子參與心臟發(fā)育的各個過程，調節(jié)著心臟特異基因的表達，敲除后會對心臟及血管的發(fā)育造成嚴重不良影響[20-21]。而MEF2C也被證實參與心肌肥厚的過程，MEF2C在發(fā)生心肌肥厚時被激活并且表達上調[22]。當特異性抑制心肌MEF2C表達后，能夠有效減輕壓力負荷所至的小鼠左室肥厚[23]。本文結果也表明，MEF2C在Ang-II誘導肥大的心肌細胞中特異地表達升高，而沉默MEF2C表達可有效抑制Ang-II誘導的心肌細胞肥大。

本文結果提示miR-214可通過抑制MEF2C表達發(fā)揮抑制心肌細胞肥大的作用，與以往miR-214通過抑制EZH2發(fā)揮促進心肌細胞肥大的報道不一致[16-17]。目前關于EZH2調控心肌細胞肥大作用的觀點尚不一致，有研究證實，增加EZH2穩(wěn)定性和生物學功能可顯著抑制心肌肥厚的發(fā)生[24]。

Figure 2.miR-214 modulated the expression of MEF2C at the transcriptional level. A: dual luciferase reporter assay; B: MEF2C expression in NMVCs exposed to Ang-Ⅱ; C: MEF2C expression in NMVCs treated with miR-214 mimic orMEF2CsiRNA. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vspGL3-promoter group;△P<0.05,△△P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsscramble group.

圖2 miR-214在轉錄水平調控MEF2C表達

Figure 3.miR-214 andMEF2CsiRNA inhibited the expression of hypertrophy-related proteins in the NMVCs. The protein expression of ACTA1, β-MHC and MEF2C in NMVCs was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsAng-II group.

圖3 miR-214和MEF2CsiRNA抑制乳小鼠心肌細胞中肥厚相關基因表達

本文發(fā)現(xiàn)miR-214在肥大的心肌細胞表達上調，通過雙螢光素酶報告基因實驗、靶基因表達和相應功能性實驗證實MEF2C是miR-214作用靶基因，介導miR-214發(fā)揮抗心肌細胞肥大作用。在后續(xù)研究中，我們將在小鼠整體水平，進一步明確miR-214對MEF2C表達和對心肌肥厚表型的調控作用。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

MEF2C mediates inhibitory effect of microRNA-214 on cardiomyocyte hypertrophy

TANG Chun-mei1, 2, ZHU Jie-ning2, ZHU Wen-si1, 2, LIN Qiu-xiong2, HU Zhi-qin1, 2, FU Yong-heng2, ZHANG Meng-zhen2, DENG Chun-yu2, TAN Hong-hong2, WU Shu-lin2, SHAN Zhi-xin1, 2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2GuangdongCardiovascularInstitute,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:zhixinshan@aliyun.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-214 (miR-214) on cardiomyocyte hypertrophy and the expression of the potential target genes. METHODS: A cell model of hypertrophy was established based on angiotensin-Ⅱ (Ang-Ⅱ)-induced neonatal mouse ventricular cardiomyocytes (NMVCs). Dual luciferase reporter assay was performed to verify the interaction between miR-214 and the 3’UTR ofMEF2C. The expression of MEF2C and hypertrophy-related genes at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot, respectively.RESULTS: The expression of ANP, ACTA1, β-MHC and miR-214 was markedly increased in Ang-Ⅱ-induced hypertrophic cardiomyocytes. Dual luciferase reporter assay revealed that miR-214 interacted with the 3’UTR ofMEF2C, and miR-214 was verified to inhibit MEF2C expression at the transcriptional level. The protein expression of MEF2C was markedly increased in the hypertro-phic cardiomyocytes. Moreover, miR-214 mimic, in parallel toMEF2CsiRNA, inhibited the expression of hypertrophy-related genes in Ang-Ⅱ-induced NMVCs. CONCLUSION:MEF2Cis a target gene of miR-214, which mediates the effect of miR-214 on attenuating cardiomyocyte hypertrophy.

Cardiac hypertrophy; MicroRNA-214; MEF2C; Cardiomyocytes

1000- 4718(2016)08- 1345- 06

2016- 04- 05

2016- 05- 13

國家自然科學基金資助項目(No. 81270222；No. 81470439)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313635)； 廣東省醫(yī)學研究基金資助項目 (No. A2015187)

R329.2+1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.001

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