鄭海倫， 趙 睿， 李大鵬， 汪強武， 汪建超， 王啟之

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化科，安徽 蚌埠 233004)

miR-625-3p在結腸癌組織和細胞中的表達*

鄭海倫， 趙 睿， 李大鵬， 汪強武， 汪建超， 王啟之△

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化科，安徽 蚌埠 233004)

目的： 探討微小RNA(miR)-625-3p在結腸癌組織和細胞中的表達，了解其作用機制。方法: 利用qRT-PCR分析結腸癌細胞株、癌組織和癌旁組織中miR-625-3p的表達水平，探討miR-625-3p表達水平與結腸癌臨床病理參數(shù)之間的關系；利用碘化丙啶染色和流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期變化；Western blot法檢測miR-625-3p對結腸癌細胞株凋亡相關蛋白的影響，初步了解其發(fā)揮影響的可能機制。結果: 結腸癌組織miR-625-3p的表達量比癌旁組織高(P<0.05)，miR-625-3p的表達量與結腸癌浸潤深度、TNM分期及有無遠處轉移關系密切(P<0.05)。miR-625-3p在結腸癌SW620細胞中的表達水平高于在SW480細胞中的表達。抑制miR-625-3p的表達能顯著抑制結腸癌細胞的周期(P<0.05)和促進凋亡；轉染miR-625-3p后， Bcl-2的表達量增加(P<0.05)，Bax表達量沒有顯著變化。結論: miR-625-3p能促進結腸癌細胞增殖，抑制結腸癌細胞凋亡，可能是結腸癌新的抗癌靶點。

結腸癌； 微小RNA-625-3p； 細胞周期； 細胞凋亡

結腸癌是消化系統(tǒng)高發(fā)腫瘤之一，其發(fā)生機制復雜，目前仍未完全明了，既往研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生與一系列癌基因激活和抑癌基因失活等變化有關[1]；其中微小RNA(microRNAs,miRNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要作用，包括細胞增殖、分化、血管發(fā)生、凋亡、侵襲轉移等[2-3]。miRNAs 表達異?？赡軙е孪鄳牡鞍妆磉_異常，這些異常表達的蛋白能發(fā)揮抑癌或促癌作用[4-5]。近來的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-625-3p(miR-625-3p)能影響奧沙利鉑對結腸癌患者的療效[6]，而且miR-625-3p能促進結腸癌細胞的侵襲和轉移[7]，同時也發(fā)現(xiàn)在惡性胸膜間皮瘤患者血循環(huán)中miR-625-3p水平升高[8]。然而miR-625-3p在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用仍不明確，值得進一步研究和探討。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自Gibco；人結腸癌細胞株SW480和SW620 購自中科院上海細胞庫，由安徽省生化藥物工程技術研究中心凍存；miR-625-3p模擬物(miR-625-3p mimics)、陰性對照(negative control, NC)模擬物、miR-625-3p 抑制劑(anti-miR-625-3p)、對照抑制劑(anti-NC)、 Lipofectamine 2000和TRIzol試劑購自Invitrogen；iScriptTMcDNA Synthesis Kit 購自Bio-Rad；ABI StepOneTMReal-Time PCR System購自 Applied Biosystems；鼠抗人Bcl-2、Bax和β-actin抗體購自 Santa Cruz。

2 研究對象

收集2013年1月～2015年6月在我院110例確診結腸癌的患者腫瘤組織及癌旁組織。結腸癌毗鄰正常組織(癌旁組織)的取材標準為距離腫瘤邊緣至少5 cm的正常結腸黏膜組織。所有患者均未行術前輔助化療或放射治療，沒有其它惡性腫瘤疾病。結腸癌臨床分期參照中國結直腸癌診療規(guī)范、美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(UICC)結直腸癌TNM分期系統(tǒng)標準進行分期。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng) 來源于結腸癌原發(fā)部位的腫瘤細胞系SW480和來源于同一結腸癌患者的轉移淋巴結腫瘤細胞系SW620由安徽省生化藥物工程技術研究中心凍存。復蘇后于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，待細胞生長狀態(tài)良好時用于實驗。

3.2 RNA提取和qRT-PCR 利用TRIzol試劑分別提取結腸癌、結腸癌毗鄰正常組織(癌旁組織)、SW480和SW620細胞中的總RNA。取含100 ng總RNA按iScriptTMcDNA Synthesis Kit操作說明書進行反轉錄cDNA。按TaqMan MicroRNA Assays說明檢測成熟miRNA，以miR-625-3p和U6為模板，miR-625-3p和U6熒光探針作引物擴增，在ABI StepOneTMReal-Time PCR System中進行反應。所有實驗重復3次，相對定量用2-ΔΔCt法分析miRNA的變化。

3.3 miR-625-3p 的轉染 miR-625-3p mi-mics和對照NC按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書轉染進入SW480細胞。Anti-miR-625-3p和對照抑制劑anti-NC按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書轉染進入SW620細胞。轉染48 h后收集細胞，利用RT-qPCR 法檢測轉染后miR-625-3p的表達。

3.4 對細胞增殖的影響 將分別轉染 miR-625-3p mimics、NC的SW480細胞和分別轉染anti-miR-625-3p、anti-NC的SW620細胞接種于6孔板中，終濃度為1×107/L，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，收集細胞，計數(shù)活細胞數(shù)量。每組3個復孔，重復3次。

3.5 對細胞周期的影響 將分別轉染 miR-625-3p mimics、NC的SW480細胞和分別轉染anti-miR-625-3p、anti-NC的SW620細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，收集細胞，預冷 PBS 洗滌 1 次，離心去除PBS，加入預冷的 70% 的乙醇固定細胞24 h，離心棄去固定液，PBS 洗滌 1 次后收集細胞于流式管，每管細胞樣品中加入1 mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液(含有100 mg/L RNase A和5 mg/L PI)，緩慢并充分重懸細胞，避光室溫孵育30 min，隨后用流式細胞儀在488 nm激發(fā)波長下檢測紅色熒光和光散射情況，并用Flowjo軟件分析細胞周期。實驗重復3次。

3.6 細胞凋亡檢測 將分別轉染 miR-625-3p mi-mics、NC的SW480細胞和分別轉染anti-miR-625-3p、anti-NC的SW620細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后獲取細胞，加入75%的冷乙醇固定，4 ℃過夜。測試前用PBS洗滌2次，每組加入600 μL PI緩沖液(5 mg PI,0.1 g NaC6H5,100 μL Triton X-100,100 μL ddH2O)，避光染色30 min，用流式細胞儀檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。實驗重復3次。

3.7 Western blot法檢測凋亡蛋白的表達 接種已轉染的細胞于6孔細胞培養(yǎng)板中。處理24 h 后消化收集細胞，用預冷PBS洗2 次。按照試劑盒說明書步驟行Western blot實驗檢測細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的變化。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，兩組間計量資料比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-625-3p在結腸癌組織中的表達

通過收集結腸癌組織及癌旁組織，并檢測組織中miR-625-3p相對表達含量，結腸癌組織miR-625-3p表達量比癌旁組織表達量高，平均高出(6.16±1.08)倍，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of miR-625-3p in colorectal cancer tissues. Mean±SD.n=110.*P<0.05vsnormal tissues.

圖1 miR-625-3p在結腸癌組織中的表達

2 結腸癌miR-625-3p的表達量與臨床病理參數(shù)之間的關系

將患者的臨床病理參數(shù)年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、TNM分期及有無遠處轉移與miR-625-3p的相對含量比較發(fā)現(xiàn)：miR-625-3p相對表達量與腫瘤浸潤深度、TNM分期和遠處轉移有相關性(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤大小的相關性無統(tǒng)計學顯著性，見表1。

3 miR-625-3p在結腸癌細胞中的表達

實驗結果表明miR-625-3p在結腸癌SW620細胞中的表達比來源于結腸癌原發(fā)部位的SW480細胞高(P<0.05)。miR-625-3p 模擬物轉染進入SW480細胞后結果顯示SW480細胞中miR-625-3p表達較對照組高(P<0.05)。miR-625-3p 抑制劑轉染進入SW620細胞后結果顯示miR-625-3p在SW620細胞中的表達較對照組低(P<0.05)，見圖2。

表1 結腸癌miR-625-3p表達與臨床病理參數(shù)之間的關系

4 miR-625-3p對結腸癌細胞增殖的影響

轉染miR-625-3p后SW480細胞隨著實驗時間延長，增殖活性明顯增強，在實驗后24 h、48 h、72 h時均具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。與anti-NC組相比，轉染anti-miR-625-3p后SW620細胞隨著實驗時間延長，增殖活性減弱，在實驗后24 h兩者無顯著性差異，實驗48 h、72 h時差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

5 miR-625-3p對結腸癌細胞周期的影響

結腸癌SW480細胞轉染miR-625-3p模擬物后，用Flowjo軟件分析細胞周期，發(fā)現(xiàn)G0/G1期與S期細胞比例都沒有明顯變化，但是G2/M期與對照組相比比例升高，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。SW620細胞轉染miR-625-3p抑制劑及陰性對照抑制劑后，用Flowjo軟件分析細胞周期發(fā)現(xiàn)G0/G1期與陰性對照組相比比例升高，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；S 期細胞比例變化不明顯；G2/M期與陰性對照組相比比例降低，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The expression of miR-625-3p in different CRC cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSW480;#P<0.05vsNC;△P<0.05vsanti-NC.

圖2 miR-625-3p在不同轉移潛能的結腸癌細胞中的表達

Figure 3.The effects of miR-625-3p on the CRC cell proliferation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC;#P<0.05vsanti-NC.

圖3 miR-625-3p對結腸癌細胞增殖的影響

Figure 4. The effects of miR-625-3p on the CRC mitotic cycle. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC;#P<0.05vsanti-NC.

圖4 miR-625-3p對結腸癌細胞周期的影響

6 miR-625-3p對細胞凋亡的影響

流式細胞術分析SW620細胞轉染miR-625-3p抑制劑及陰性對照抑制劑后，發(fā)現(xiàn)轉染miR-625-3p抑制劑后的細胞凋亡率比陰性對照組細胞凋亡率要高，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，說明抑制miR-625-3p能促進細胞凋亡。但是SW480細胞轉染miR-625-3p模擬物與對照組相比，細胞凋亡率沒有明顯變化，見圖5。

Figure 5. The effects of miR-625-3p on the CRC cell apoptosis.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC;#P<0.05vsanti-NC.

圖5 miR-625-3p對結腸癌細胞凋亡的影響

7 miR-625-3p對結腸癌細胞Bcl-2/Bax蛋白的影響

用Western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達,結果表明，Bax在SW480細胞中高表達，轉染miR-625-3p后，Bax表達量沒有顯著變化；在SW620細胞中轉染anti-miR-625-3p后Bax表達量顯著升高(P<0.05)。Bcl-2在SW480細胞中轉染anti-miR-625-3p后，Bcl-2的表達量顯著增加；Bcl-2在SW620細胞中轉染anti-miR-625-3p后Bax的表達量顯著降低(P<0.05)，見圖6。

討 論

結腸癌在我國發(fā)病率較高，最新報道的統(tǒng)計資料表明我國僅在2015年結腸癌新發(fā)病例達到37.6萬，死亡人數(shù)達到19.1萬人，在所有腫瘤中排第5位[9]。目前在結腸癌的診治方面取得了重要的進展，患者的預后主要取決于結腸癌的進展，因此，研究結腸癌發(fā)生發(fā)展的機制和探索治療的新靶點成為目前研究的重點和熱點。最近的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs家族中miR-625-3p與包括結腸癌在內(nèi)的腫瘤發(fā)生發(fā)展可能有關。

本實驗結果表明miR-625-3p在結腸癌組織和癌旁組織中的表達差異有統(tǒng)計學顯著性，在結腸癌組織中的表達遠遠高于癌旁組織，通過進一步分析miR-625-3p與結腸癌臨床特征的關系，發(fā)現(xiàn)miR-625-3p的相對表達量與腫瘤浸潤深度、TNM分期和遠處轉移有關系。這些結果表明miR-625-3p在結腸癌組織與癌旁組織之間表達存在差異，提示miR-625-3p與結腸癌的病理生理有關，在一定程度上也可能是促進結腸癌細胞增殖、侵襲轉移的因素。既往文獻報道[10]miR-625-3p能夠增強肝癌細胞的侵襲轉移，而我們的實驗在結腸癌組織中也發(fā)現(xiàn)了類似的結果，進一步說明miR-625-3p參與了結腸癌的發(fā)生發(fā)展。如同在肝癌中所起作用一樣，miR-625-3p可能扮演著癌基因的作用，具有促進腫瘤細胞增殖、分化、侵襲的功能[7-8]。進一步在細胞實驗的驗證中，我們采用了具有同一遺傳背景的2種侵襲轉移潛能不同的細胞：來源于結腸癌原發(fā)部位的腫瘤細胞系SW480細胞，和來源于同一結腸癌患者的轉移淋巴結腫瘤細胞系SW620細胞[11]，因來源于同一患者，具有相同的遺傳背景，因此實驗結果更具有可比性。實驗結果表明miR-625-3p在轉移性結腸癌SW620細胞中的表達高于來源于結腸癌原發(fā)部位的SW480細胞中的表達，這表明miR-625-3p的表達不僅與結腸癌細胞的增殖有關，而且與侵襲轉移能力相關。

Figure 6.The effects of miR-625-3p on the protein exprossion of Bcl-2 and Bax in the CRC cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC;#P<0.05vsanti-NC.

圖6 miR-625-3p對結腸癌細胞Bcl-2/Bax蛋白表達的影響

腫瘤細胞的特征不僅表現(xiàn)為侵襲轉移，而且癌細胞一般具有潛力無限的復制能力，細胞周期是細胞保持正常生命活動的基本過程，而腫瘤的細胞周期會發(fā)生異常，其與正常細胞顯著不同的是具有無限增殖潛能，導致腫瘤一系列癥狀的發(fā)生，因此阻滯腫瘤細胞周期能有效地發(fā)揮抗腫瘤作用。在細胞周期中存在一些細胞周期調(diào)控位點，如G1-S調(diào)控點、S-G2/M 期調(diào)控點等，這些檢測點能調(diào)控細胞各周期之間的轉換，當細胞周期轉換受到外界干擾就有可能被阻滯在某一檢測點之前，形成周期阻滯，從而導致細胞停止增殖發(fā)育。影響細胞周期的因素很多，既往有文獻報道m(xù)icroRNA能夠?qū)毎芷诎l(fā)揮影響[12]。本研究證實轉染miR-625-3p抑制劑后處于G0/G1期細胞比例升高，G2/M期細胞比例降低。當處于 G0/G1細胞越多，S 期細胞越少時，細胞的增殖速度就會越低，這也是很多其它抗腫瘤藥物產(chǎn)生抑制腫瘤細胞增殖的機制之一。結合既往文獻報道[8]及相關的結腸癌與miRNAs的關系，可以推測在結腸癌細胞的增殖中miR-625-3p具有重要的影響，其抑制后可能會對腫瘤細胞周期發(fā)揮阻滯作用。這可能從反面證實miR-625-3p對細胞周期的轉換具有促進作用，能夠促進腫瘤細胞的增殖。在研究miR-625-3p對結腸癌細胞增殖影響的實驗中，發(fā)現(xiàn)miR-625-3p直接促進了結腸癌細胞的增殖。

目前對miR-625-3p如何促進結腸癌細胞的增殖和侵襲轉移的機制仍不明確，miR-625-3p可能對結腸癌細胞的某些基因發(fā)揮了影響。為探討miR-625-3p對結腸癌細胞中癌基因及抑癌基因表達的影響，在細胞中轉染了miR-625-3p擬似物和抑制劑，實驗結果表明miR-625-3p能促進細胞凋亡，進一步實驗研究結果顯示miR-625-3p能夠促進Bcl-2的表達，miR-625-3p抑制劑能夠抑制Bax的表達。Bcl-2是抗凋亡蛋白，在結腸癌細胞中高表達，調(diào)控結腸癌細胞的增殖和發(fā)生發(fā)展，其對應的促凋亡蛋白Bax能夠通過細胞色素C途徑激活caspases 家族，導致結腸癌細胞發(fā)生凋亡[13-14]。miR-625-3p通過哪種途徑對結腸癌細胞中Bcl-2/Bax發(fā)揮調(diào)控作用，還有待進一步的研究。

總之，本研究從臨床結腸癌標本和細胞中均證實了miR-625-3p對結腸癌的發(fā)生發(fā)展(如增殖、凋亡、侵襲轉移方面)發(fā)揮了重要作用，并調(diào)控了結腸癌細胞中Bcl-2/Bax的表達，這也證實miR-625-3p可能是結腸癌新的抗癌靶點，為以后進一步研究打下了基礎。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression of miR-625-3p in colorectal carcinoma tissues and cells

ZHENG Hai-lun, ZHAO Rui, LI Da-peng, WANG Qiang-wu, WANG Jian-chao, WANG Qi-zhi

(DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China.E-mail: 329565877@qq.com)

AIM: To investigate the expression of microRNA-625-3p (miR-625-3p) in colorectal carcinoma (CRC) and its underlying mechanism. METHODS: Quantitative real-time PCR was employed to detect the levels of miR-625-3p expression in different CRC cell lines, CRC tissues and pair-matched adjacent normal tissues. The relationships between the expression levels of miR-625-3p and the patients’ clinicopathological parameters were estimated. The effects of miR-625-3p on the apoptosis and the cell mitotic cycle of CRC cells were analyzed with propidium iodide staining and flow cytometry. The effect of miR-625-3p on the apoptosis-related proteins was analyzed by Western blot. RESULTS: The expression level of miR-625-3p in the CRC tissues was higher than that in the pair-matched adjacent normal tissues (P<0.05). The expression of miR-625-3p in the CRC tumor tissues was significantly correlated with the tumor infiltrative depth, TNM stage and distant metastasis (P<0.05). The expression levels of miR-625-3p in CRC SW620 cells were higher than that in SW480 cells. The CRC cell mitotic cycle was significantly inhibited and cell apoptosis was significantly promoted when the expression of miR-625-3p was inhibited (P<0.05). The expression of Bax protein didn’t change and the expression of Bcl-2 protein increased after miR-625-3p mimics were transfected into CRC SW620 cells(P<0.05). CONCLUSION: miR-625-3p may be a promising approach for the treatment of CRC by promoting cell proliferation and inhibiting apoptosis.

Colorectal carcinoma; MicroRNA-625-3p; Cell cycle; Apoptosis

1000- 4718(2016)08- 1376- 07

2016- 04- 11

2016- 06- 27

國家自然科學基金資助項目(No. 81372899)；安徽省高等學校自然科學研究項目(No. KJ2015A177)

R574.62； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.006

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△通訊作者 Tel: 0552-3086125; E-mail: 329565877@qq.com