劉清華， 于國華， 劉雨清

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1人體解剖學(xué)教研室， 2病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053； 3濰坊市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 濰坊 261041)

CCR7和VEGF-C蛋白與乳腺癌預(yù)后之間的關(guān)系*

劉清華1， 于國華3， 劉雨清2

(濰坊醫(yī)學(xué)院1人體解剖學(xué)教研室，2病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；3濰坊市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 濰坊 261041)

目的： 探討趨化因子受體7(CCR7)及血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平，并分析二者與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。方法: 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，聯(lián)合檢測CCR7和VEGF-C蛋白分別在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達(dá)差異情況，并分析二者與乳腺癌各相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法來評估CCR7及VEGF-C蛋白的異常表達(dá)與乳腺癌患者生存期之間的關(guān)系。結(jié)果: CCR7蛋白在乳腺癌組織(68%)中的陽性表達(dá)率高于正常乳腺組織(30%)，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0．01)；而VEGF-C蛋白在乳腺癌組織(71%)中的陽性表達(dá)率也明顯高于正常乳腺組織(24%)，差異也有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0．01)。且在乳腺癌組織中，CCR7與VEGF-C蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.613，P<0．01)。CCR7和VEGF-C蛋白的高表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0．05)，而與年齡、腫瘤大小、雌激素受體和孕激素受體均無關(guān)。CCR7及VEGF-C蛋白陽性表達(dá)者的生存期低于陰性表達(dá)者，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0．05)。結(jié)論: CCR7與VEGF-C的異常高表達(dá)可能與乳腺癌預(yù)后關(guān)系密切，二者可作為判斷乳腺癌預(yù)后不良的重要指標(biāo)之一。

趨化因子受體7； 血管內(nèi)皮生長因子C； 乳腺癌

目前，乳腺癌的發(fā)病率已躍居女性惡性腫瘤的首位[1]，且有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要決定性因素之一。基因定位于17q12～q21.2區(qū)域的趨化因子受體7(chemokine receptor 7，CCR7)與其它趨化因子一樣，是一種G-蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體。有研究發(fā)現(xiàn)，CCR7與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[2]。血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)作為新發(fā)現(xiàn)的生長因子家族成員之一，可與酪氨酸激酶受體VEGFR-3結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤淋巴管及血管的生成，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[3]。目前，CCR7和VEGF-C是否在乳腺癌組織的轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用，尚不完全清楚。但已有研究表明，有效控制影響惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素，對提高臨床治療和改善患者的預(yù)后有重要意義。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)Max VisionTM二步法，分別檢測CCR7和VEGF-C蛋白在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析二者與乳腺癌各相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系，從而為乳腺癌的分子靶向治療及預(yù)后評估等提供新的靶點和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 一般資料

選取2009年1月～2015年12月在濰坊市人民醫(yī)院腫瘤科行手術(shù)治療的乳腺癌患者85例，其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例。術(shù)后乳腺癌標(biāo)本均做石蠟包埋。乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本按照AJCC乳腺癌臨床分期(2003)標(biāo)準(zhǔn)分類，TNMⅠ期20例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例，Ⅳ期23例。所有患者術(shù)前均未接受任何化療和抗腫瘤治療，術(shù)后常規(guī)病理診斷(HE染色)確診為乳腺癌。且術(shù)后均在腫瘤科接受化療，隨訪資料完整?；颊呱嫫趶氖中g(shù)之日開始計算, 終止日期為腫瘤復(fù)發(fā)日期或末次隨訪日。截止日期為2015年12月30 日，隨訪期限為6～84個月不等。發(fā)病年齡為28～80歲，平均年齡(54.0±10.7)歲。同時，取乳腺癌5 cm以外的正常乳腺組織50例作為陰性對照。

2 試劑與方法

兔抗人CCR7多克隆抗體、兔抗人VEGF-C多克隆抗體、通用型二步法免疫組化檢測PV-9000試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。所有實驗組織均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，以5 μm厚連續(xù)切片。免疫組化技術(shù)采取Max VisionTM兩步法，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS液代替 I 抗作為陰性對照。

3 結(jié)果判定

采用雙盲法，分別對CCR7和VEGF-C蛋白染色結(jié)果進(jìn)行評判。CCR7和VEGF-C蛋白陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，背景清晰，染成淡黃色、棕黃色或棕褐色。根據(jù)陽性細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞計數(shù)進(jìn)行綜合評分。染色強度分類為：無著色計0分，淡黃色計1分，黃或棕黃色計2分，褐或棕褐色計3分。對陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)：根據(jù)陽性細(xì)胞所占5個以上高倍鏡視野比例計數(shù)，0分為陽性細(xì)胞<5%，1分為5%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為≥76%。二者積分相乘，0～4分為(-)，5～12分為(+)，≥4分者為高表達(dá)，<4分為低表達(dá)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 CCR7和VEGF-C蛋白在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)

CCR7蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率(68%)高于正常乳腺組織(30%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。VEGF-C蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率(71%)也高于正常乳腺組織(24%)，兩組比較差異也有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1、2及表1。

2 CCR7和VEGF-C蛋白在乳腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級分析結(jié)果表明，在乳腺癌組織中CCR7和VEGF-C蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.613，P<0.01)。

3 乳腺癌組織中CCR7和VEGF-C的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

CCR7和VEGF-C異常高表達(dá)均與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小、雌激素受體(estrogen receptor，ER)和孕激素受體(progesterone receptor，PR)均無關(guān)，見表2。

Figure 1.The protein expression of CCR7 in normal breast tissue (A, ×100) and breast cancer tissue (B, ×400).

圖1 CCR7在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)

Figure 2.The protein expression of VEGF-C in normal breast tissue (A,×100) and breast cancer tissue (B,×400).

圖2 VEGF-C在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)

表1 CCR7和VEGF-C在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá)

表2 CCR7和VEGF-C在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Table 2.The relationship between the expression of CCR7 and VEGF-C and clinicopathologic characteristics of the patients with breast cancer

ClinicopathologiccharacteristicsnCCR7VEGF-C+-Positiverate(%)2P+-Positiverate(%)2PAge(year)1.450.2301.170.280 <5055401573411475 ≥5030181260191163Lymphnodemetastasis9.710.00212.700.001 Yes5242108144885 No33161748161748Primarytumorsize(cm)1.110.2900.740.390 ≤260431772441673 >22515106016964TNMstage6.020.0145.970.015 Ⅰ～Ⅱ40211953202050 Ⅲ～Ⅳ45351078341176ER0.170.6801.710.190 +50351570381276 -35231266221363PR0.340.5600.290.590 +48341471351373 -37241365251268

ER: estrogen receptor; PR: progesterone receptor.

4 CCR7和VEGF-C蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者生存期之間的關(guān)系

從Kaplan-Meier生存曲線可見CCR7蛋白陽性表達(dá)者的生存期低于陰性表達(dá)者，經(jīng)log-rank時序檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。VEGF-C蛋白陽性表達(dá)者的生存期也明顯低于陰性表達(dá)者，經(jīng)log-rank時序檢驗，兩組差異也有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The relationship between the expression of CCR7 and VEGF-C and survival time of the breast cancer patients.

圖3 CCR7和VEGF-C表達(dá)與乳腺癌患者生存時間的關(guān)系

討 論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的和多步驟的過程，很多因子參與了這一過程[4]。陳祥錦等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CCR7在乳腺癌、癌旁組織及乳腺良性腫瘤中的陽性表達(dá)率分別為50.0%、18.4%和15.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性；且CCR7的高表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究顯示，CCR7在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織，且CCR7蛋白的高表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，而與年齡、腫瘤大小、雌激素受體、孕激素受體均無關(guān)，說明CCR7蛋白與乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，其機制可能是CCR7與其特異性受體(CCL19和CCL21)結(jié)合后，通過激活PI3K/Akt信號通路，從而調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

VEGF-C 作為最早被發(fā)現(xiàn)的促淋巴管生成因子，具有調(diào)節(jié)血管生成、淋巴管生成和脈管通透性等作用[6]。有研究表明[7]，VEGF-C與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中腫瘤新生血管的生成關(guān)系密切。劉新蘭等[8]研究表明，乳腺癌組織中hMAM、VEGF-C及VEGFR-3的陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，且三者的表達(dá)與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而hMAM、VEGF-C及VEGFR-3在乳腺癌中的表達(dá)兩兩之間也均呈正相關(guān)。本研究顯示，VEGF-C在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率也明顯高于正常乳腺組織，且VEGF-C蛋白的高表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，而與年齡、腫瘤大小、雌激素受體、孕激素受體均無關(guān)，提示VEGF-C的高達(dá)表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，其具體機制可能是腫瘤細(xì)胞通過自分泌或旁分泌VEGF-C蛋白，并與VEGFR-3特異性結(jié)合后，從而提高了腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處組織侵襲、轉(zhuǎn)移的能力。

經(jīng)Spearman等級分析結(jié)果表明，在乳腺癌組織中，CCR7與VEGF-C蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。說明二者在促進(jìn)乳腺癌向周圍侵襲過程中起著協(xié)同作用，推斷機制可能是VEGF-C增加淋巴管分泌CCL21，CCL21的上調(diào)可與CCR7特異性結(jié)合，從而促進(jìn)表達(dá)CCR7的腫瘤細(xì)胞向淋巴管轉(zhuǎn)移；同時VEGF-C的分泌還可以增加蛋白水解酶的活性和腫瘤細(xì)胞變形運動。夏欣等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中，VEGF-C和CCR7的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性。經(jīng)log-rank時序檢驗發(fā)現(xiàn)，CCR7及VEGF-C蛋白陽性表達(dá)者的中位生存期均低于陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性，提示二者均為乳腺癌預(yù)后的不良因素，其陽性表達(dá)患者的生存率較陰性更低，生存期可能更短，預(yù)后也可能更差。因此，聯(lián)合檢測CCR7及VEGF-C的表達(dá)水平，可以更加準(zhǔn)確、客觀地評價乳腺癌患者的預(yù)后，從而以此作為抗腫瘤治療的靶點，抑制乳腺癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，最終提高患者的生存期。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Expression of chemokine receptor CCR7 and VEGF-C is associated with prognosis of breast carcinoma

LIU Qing-hua1, YU Guo-hua3, LIU Yu-qing2

(1DepartmentofAnatomy,2DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China;3DepartmentofMedicalOncology,WeifangPeople’sHospital,Weifang261041,China.E-mail:yuqingliu89@hotmail.com)

AIM: To explore the protein levels of chemokine receptor 7 (CCR7) and vascular endothelial growth factor (VEGF)-C in breast carcinoma, and to investigate the effects of CCR7 and VEGF-C on prognosis of breast carcinoma. METHODS: The protein expression levels of CCR7 and VEGF-C in the breast carcinoma tissues and normal breast tissues were detected by the method of immunohistochemistry. At the same time, the relationship between clinicopathologic characteristics and the protein expression of CCR7 and VEGF-C in the breast carcinoma tissues was analyzed. The relationship between the protein expression of CCR7 and VEGF-C and survival time of the breast cancer patients was estimated by Kaplan-Meier method.RESULTS: The positive expression rates of CCR7 and VEGF-C in the breast carcinoma tissues were significantly higher than those in the normal breast tissues (P<0．01). A positive correlation was observed between the protein expression of CCR7 and the protein expression of VEGF-C in the breast carcinoma tissues (r=0.613,P<0．01). The protein expression of CCR7 and VEGF-C was correlated with lymph node metastasis and TNM stage (P<0．05), but both were not related to patients’ age, primary tumor size, estrogen receptor and progesterone receptor. The survival time of the patients with CCR7 and VEGF-C positive expression was significantly shorter than that of the patients without the expression (P<0．05).CONCLUSION: The positive expression of CCR7 and VEGF-C proteins is associated with the prognosis of breast cancer, and combined detection of CCR7 and VEGF-C protein expression levels may be helpful to judge the prognosis of breast cancer.

Chemokine receptor 7; Vascular endothelial growth factor-C; Breast carcinoma

1000- 4718(2016)08- 1457- 05

2016- 04- 22

2016- 05- 27

山東省自然科學(xué)基金資助項目(No. ZR2014HL077)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.020

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