榮季冬， 李 玲， 龍仙萍， 鄧文文， 石 蓓

(遵義醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

慢病毒載體介導的降鈣素基因相關肽轉染對心臟干細胞活力的影響*

榮季冬， 李 玲， 龍仙萍， 鄧文文， 石 蓓△

(遵義醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

目的： 探討攜帶降鈣素基因相關肽(CGRP)的慢病毒體外轉染對大鼠c-kitpos心臟干細胞(c-kit+CSCs)活力的影響。方法: 無菌條件下取出SD大鼠的心耳，采用酶消化法結合免疫磁珠法獲取c-kit+CSCs，并通過流式細胞術鑒定；將攜帶目的基因的重組慢病毒載體(Lv-EGFP-CGRP)及空病毒載體(Lv-EGFP)分別轉染至c-kit+CSCs，實驗分為3組： Lv-EGFP-CGRP-CSCs組、Lv-EGFP-CSCs組和CSCs組；在熒光顯微鏡下觀察轉染情況，采用流式細胞技術測定其轉染率，采用ELISA測定各組培養(yǎng)上清液中CGRP的濃度，采用CCK-8法檢測慢病毒轉染對c-kit+CSCs活力的影響。結果: 成功分離培養(yǎng)獲取c-kit+CSCs，流式細胞術鑒定顯示其高表達c-kit(為91.0%)，低表達CD45及CD34；成功轉染慢病毒的大鼠c-kit+CSCs可表達綠色熒光，48 h后可穩(wěn)定表達，感染復數(shù)(MOI)值為20時，熒光顯微鏡觀察及流式細胞術結果均顯示轉染率達80%以上；ELISA結果示，Lv-EGFP-CGRP-CSCs組細胞上清液CGRP分泌量較Lv-EGFP-CSCs組和CSCs組增加(P<0.01)； CCK-8檢測細胞活力的結果顯示，慢病毒轉染不影響c-kit+CSCs的活力。結論: 攜帶CGRP的慢病毒載體可成功轉染至c-kit+CSCs，轉染Lv-EGFP-CGRP后的c-kit+CSCs可合成和分泌CGRP蛋白至上清液中，且轉染后c-kit+CSCs的活力未受影響。這為基因工程細胞療法治療心肌梗死提供了新的理論及實驗依據(jù)。

降鈣素基因相關肽； 慢病毒載體； 心臟干細胞； 細胞活力

c-kit+心臟干細胞(c-kitposcardiac stem cells，c-kit+CSCs)具有心臟組織的特異性，有向心肌細胞、血管平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞定向分化的潛能，被認為可能是細胞移植治療心肌梗死最理想的種子細胞[1-3]。但干細胞移植治療心肌梗死仍面臨著諸多問題，如移植存活率低，在體內(nèi)增殖、分化為有功能的細胞少，使其修復心肌的能力受到限制，遠達不到預期療效。細胞基因修飾的方法可在一定程度上提高干細胞功能，從而改善預后。研究發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)有抗炎、調(diào)節(jié)免疫及炎性反應、抗凋亡作用。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)CGRP可調(diào)節(jié)急性心肌梗死后的炎癥環(huán)境，從而改善梗死后心功能[4-5]。故本實驗將攜帶CGRP的慢病毒載體轉染至大鼠c-kit+CSCs使其過表達CGRP，并觀察其對細胞活力的影響，以期為c-kit+CSCs移植治療心肌梗死提供新的思路，并為進一步的體內(nèi)研究打下基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

HAM’S/F-12培養(yǎng)液、胎牛血清(HyClone)；胰蛋白酶(Gibco)；雙抗(Solarbio)；大鼠重組(人)堿性成纖維細胞生長因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，rhbFGF)(Peprotech)；包被羊抗兔 II 抗的磁珠(Dynal Biotech)；兔抗大鼠c-kit抗體(Biorbyt)；APC標記羊抗兔 II 抗(Advansta)；PE標記小鼠抗大鼠CD45和PE標記小鼠抗大鼠CD34(Biolegend)；過表達CGRP的慢病毒載體(Lv-EGFP-CGRP)和僅含增強型GFP的慢病毒載體(Lv-EGFP)(上海英為信公司)；細胞計數(shù)CCK-8試劑盒(上海碧云天生物公司)；CGRP ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠c-kit+CSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 參考課題組前期實驗[6]，取健康清潔SD大鼠(體重50～100 g)的左、右心耳， 在含有HAM’S/F-12培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿中減碎組織(大小約1 mm3)， II型膠原酶(將其用HAM’S/F-12培養(yǎng)液稀釋成1 g/L)消化(37 ℃水浴箱，40 min)，離心(1 200 r/min，5 min)，去上清，再加入F12完全培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中，至37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換液 1 次；繼續(xù)培養(yǎng)細胞融合至80%～90%時采用磁珠分選以獲取c-kit+CSCs，分選出的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，最后采用流式細胞儀鑒定培養(yǎng)細胞的純度。

2.2 慢病毒轉染c-kit+CSCs及其細胞上清CGRP的檢測 取磁珠分選后的細胞，按每孔(3～5)×104個的細胞密度接種于24孔板中，37 ℃孵箱過夜，后吸走培養(yǎng)基(如果細胞生長良好、密度適宜，可不用換液)，再每孔加入1% 胎牛血清培養(yǎng)基500 μL，按感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值不同(5、10、20和40)分組滴加Lv-EGFP-CGRP及Lv-EGFP病毒液，混勻后培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2孵育過夜或24 h后更換成正常的培養(yǎng)基，分別于轉染后24 h、48 h、72 h和96 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞，并人工計數(shù)轉染率(每組3個復孔，每孔至少計數(shù)3個視野)；然后將計數(shù)為最佳MOI的細胞消化、離心，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗后重懸，用流式細胞術進一步檢測其轉染率。

用Lv-EGFP-CGRP和Lv-EGFP分別轉染c-kit+CSCs(Lv-EGFP-CGRP-CSCs組和Lv-EGFP-CSCs組)，以單純CSCs(CSCs組)作對照。通過ELISA檢測CGRP修飾CSCs的培養(yǎng)上清中CGRP濃度：取磁珠分選后的細胞按5×105個的細胞密度接種于6孔板中，用MOI=20的Lv-CGRP轉染CSCs 48 h并穩(wěn)定表達后，棄培養(yǎng)基、PBS沖洗3次，重新加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集上清行ELISA檢測。按照說明書操作，用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度(A)值。

2.3 慢病毒轉染后對c-kit+CSCs細胞活力的影響 將磁珠分選后的細胞按5×103個細胞密度接種于96孔板中，過夜后進行Lv-EGFP-CGRP和Lv-EGFP病毒轉染24 h后，每天分別取3組(每組6孔)行CCK-8實驗，連續(xù)6 d。將檢測孔中培養(yǎng)液吸掉，每孔加入100 μL F12完全培養(yǎng)基及10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h后于紫外分光光度計取波長450 nm進行比色，測定各孔A值。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。所有參數(shù)均用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間采用單因素方差分析和 Bonferroni校正的t檢驗檢測組間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 大鼠c-kit+CSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

心耳組織塊經(jīng)過酶消化離心后獲得的單細胞懸液接種到 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，2 d后換液可見少量細胞貼壁生長，散在呈橢圓形或短棒狀；培養(yǎng)至1周左右貼壁較好，細胞呈三角形、梭形、多角形。貼壁后快速向四周擴增生長，大約 13 d 可達到 80%～90%的融合。磁珠分選后3 d左右可見少量細胞貼壁，細胞表面仍可見單個或多個磁珠，大約10 d可達到 80%～90%的融合，見圖1。流式細胞術檢測培養(yǎng)的細胞，結果顯示細胞表達c-kit的陽性率為91.0%，CD45陽性率4.5%，CD34陽性率4.0%，符合CSCs的表型特征，見圖2。

Figure 1.Culture of rat CSCsinvitro. A: primary cells cultured for 13 d (×100); B: the cells were selected by magnetic beads for 3 d (×200); C: the cells were selected by magnetic beads for 3 d (×400).

圖1 CSCs體外培養(yǎng)

Figure 2.c-kit+CSCs were analyzed by flow cytometry.

圖2 流式細胞術鑒定c-kit+CSCs

2 慢病毒轉染大鼠CSCs的轉染率測定

倒置熒光顯微鏡下觀察被轉染Lv-EGFP-CGRP及Lv-EGFP成功的大鼠c-kit+CSCs可見綠色熒光的表達，48 h后即可穩(wěn)定表達，時間再往后轉染率、熒光強度均無明顯增加(圖3)；通過流式分析轉染率，我們可以得出Lv-EGFP-CGRP在MOI為20時可以達到最佳轉染效果，轉染率為86.0%(圖4)。

Figure 3.c-kit+CSCs were transfected for 48 h(×100). A: the cells were selected by magnetic beads for 13 d; B: c-kit+CSCs were transfected for 48 h; C: c-kit+CSCs were transfected for 72 h.

圖3 Lv-EGFP-CGRP轉染48 h后的c-kit+CSCs

Figure 4.The cell transfection efficiency was measured by flow cytometry.

圖4 Lv-EGFP-CGRP轉染c-kit+CSCs 48 h后流式細胞術的檢測結果

3 c-kit+CSCs培養(yǎng)上清中CGRP的分泌水平

ELISA檢測CSCs組、Lv-EGFP-CSCs及Lv-EGFP-CGRP-CSCs組上清中CGRP的分泌水平，結果顯示單純CSCs組和Lv-EGFP-CSCs組培養(yǎng)48 h后的上清中幾乎無CGRP檢出，而Lv-EGFP-CGRP-CSCs組培養(yǎng)48 h后的上清中有CGRP檢出，濃度為25.71 ng/L，明顯多于前2 組(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.The expression of CGRP in the CSCs culture supernatant was detected by ELISA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCSCs group and Lv-EGFP-CSCs group.

圖5 ELISA檢測c-kit+CSCs培養(yǎng)上清CGRP的表達

4 病毒轉染對c-kit+CSCs細胞活力的影響

通過CCK-8法檢測Lv-EGFP-CSCs組、Lv-EGFP-CGRP-CSCs組和CSCs組的A值，組間相比，病毒轉染后第1～6天，各組間差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖6。

Figure 6.The effect of virus transfection on the viability of c-kit+CSCs. Mean±SD.n=3.

圖6 病毒轉染對c-kit+CSCs活力的影響

討 論

心臟干細胞根據(jù)其表面標志及來源不同分為以下8種類型：c-kit+/Lin-心臟干細胞、Sca-1+心臟干細胞、Isl1+心臟干細胞、側群細胞、心球樣細胞團源性細胞、CSph、SSEA-1+心臟干細胞及EPDCs。研究發(fā)現(xiàn)c-kit+CSCs對心肌的修復作用最強[7]。Beltrami 等[8]證實了c-kit+CSCs可向心肌細胞、平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞分化。Linke等[9]發(fā)現(xiàn)，在犬的心臟組織中c-kit+細胞所占心臟干細胞比例最大，分化能力也是最強。c-kit+CSCs是最早發(fā)現(xiàn)的CSCs，與其它CSCs相比，其分化為心肌細胞的能力最強，對心臟修復能力也最強。如何分離提取高純度的c-kit+CSCs成為心肌梗死后細胞療法的關鍵。目前對于c-kit+CSCs分離、培養(yǎng)方法各家報道均不一致，但由于c-kit+CSCs多存在于心臟的心耳中[10-11]，故本實驗取材大鼠心耳。采用心耳消化法[12]經(jīng)膠原酶消化后直接通過單細胞培養(yǎng)，與既往的培養(yǎng)方法相比，避免了細胞從組織塊中緩慢逐漸爬出的過程，縮短了細胞培養(yǎng)周期，且獲取的細胞量更多。獲取的細胞再通過免疫磁珠分選法獲取c-kit+CSCs。使用流式細胞術檢測所培養(yǎng)細胞的表面標志物(c-kit、CD45和CD34)，結果顯示：c-kit高表達，為91.0%；CD34和CD45極低表達，分別為4.0%和4.5%，說明通過本實驗的細胞培養(yǎng)方法可得到純度較高的c-kit+CSCs。

盡管c-kit+CSCs被證實有修復心肌的作用，但心肌梗死后移植CSCs存活數(shù)量的減少及死亡的增加都使得CSCs遷移、增殖及分化作用受到極大的限制，大大地減弱了其對心肌梗死的治療效果。而細胞基因修飾可在一定程度上改善這一現(xiàn)狀。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)CGRP基因敲除鼠缺血再灌注損傷后心功能顯著降低，這提示它與心肌的內(nèi)源性保護作用有關。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CGRP可通過促進VEGF、IGF、HGF等血管生長因子的分泌發(fā)揮強大的心血管保護作用(促內(nèi)皮化及血管發(fā)生)，而這些血管生長因子可促進c-kit+CSCs的增殖、存活及分化而發(fā)揮心肌修復作用，減小心肌梗死面積，改善心功能[14-15]。這提示我們CGRP與c-kit+CSCs存在某種關聯(lián)，因此選擇CGRP為目的基因修飾c-kit+CSCs。

如何選擇合適的載體來進行c-kit+CSCs的基因修飾呢？目前的基因載體有腺病毒、慢病毒和質粒，其中慢病毒載體較其它病毒載體具有既可感染分裂期細胞，也可感染靜止期細胞，還可整合于宿主基因組內(nèi)，并隨細胞基因組的分裂而分離，實現(xiàn)基因穩(wěn)定長效表達，感染效率更高，容納外源性目的基因片段大，免疫原性小，生物安全性好等優(yōu)點，可作為基因治療的理想載體[16-17]。攜帶CGRP的慢病毒是否可在體外成功轉染c-kit+CSCs呢？通過對慢病毒自身攜帶的EGFP進行觀察、檢測進一步明確其轉染是否成功。當然首先是確定轉染c-kit+CSCs所需病毒的最佳MOI。目前認為MOI是指病毒載體轉染細胞時病毒與細胞的比值，MOI值隨靶細胞不同、實驗條件不同而有一定變化。本實驗按MOI=5、10、20、40對靶細胞進行轉染，在24 h、48 h、96 h及120 h用熒光顯微鏡觀察其綠色熒光的表達量、細胞形態(tài)，明暗視野計數(shù)來計算轉染率。結果發(fā)現(xiàn)MOI值為20時細胞形態(tài)及生長未受到抑制，48 h后熒光表達穩(wěn)定。此時用流式細胞術測轉染效率也得到較滿意的結果(達86.0%)。因此，選擇MOI=20為最佳感染復數(shù)。轉染后的c-kit+CSCs是否有分泌CGRP蛋白的功能呢？本實驗對成功轉染病毒的c-kit+CSCs上清進行ELISA檢測，結果顯示以MOI=20轉染c-kit+CSCs后48 h，重新?lián)Q液的培養(yǎng)基中48 h CGRP分泌量達高峰，為25.71 ng/L，而單純c-kit+CSCs和空病毒轉染c-kit+CSCs的培養(yǎng)上清中幾乎沒有CGRP的分泌。本實驗應用CCK-8法檢測CGRP對細胞活力的影響，結果顯示Lv-EGFP-CGRP-CSCs組與CSCs組及Lv-EGFP-CSCs組比較，其細胞活力無明顯差異。說明經(jīng)CGRP基因修飾的CSCs的生長能力與CSCs組和Lv-EGFP-CSCs組無差異。

綜上所述，經(jīng)慢病毒介導的目的基因CGRP可成功導入c-kit+CSCs，且轉染后的c-kit+CSCs可穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，并能分泌CGRP，除此外慢病毒轉染c-kit+CSCs后其生長能力不受影響。這些為接下來的體內(nèi)實驗奠定了基礎。提示c-kit+CSCs是一種理想的基因載體細胞，可作為CGRP基因轉染的靶細胞用于基因治療。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Transfection of calcitonin gene-related peptide mediated by lentivirus vectorinvitroand its effects on cardiac stem cell viability

RONG Ji-dong, LI Ling, LONG Xian-ping, DENG Wen-wen, SHI Bei

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:shibei2147@163.com)

AIM: To investigate the effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP)transfection into c-kitposcardiac stem cells (c-kit+CSCs) on the cell viability. METHODS: Under the sterile condition, the auricles of SD rats were taken out,and then c-kit+CSCs were collected through enzyme digestion and immunomagnetic bead separation (MACS). The cells were identified by flow cytometry. c-kit+CSCs were transfected with enhanced green fluorescent protein CGRP lentiviral vector (Lv-EGFP-CGRP) or enhanced green fluorescent protein lentiviral vector (Lv-EGFP). The cells were randomly divided into Lv-EGFP-CGRP-CSCs group, Lv-EGFP-CSCs group and CSCs group. The transfection was observed under the fluorescence microscope. The transfection efficiency was detected by flow cytometry. The CGRP protein secretion in the cell culture supernatants was detected by ELISA. The viability of c-kit+CSCs transfected with Lv-EGFP-CGRP or Lv-EGFP was measured by CCK-8 assay. RESULTS: c-kit+CSCs were isolated and cultured successfully. The expression positive rate of c-kit was 91.0% and the expression positive rates of CD45 and CD34 were 4.5% and 4.0%, respectively. After transfected with lentivirus for 48 h, the stable fluorescence in c-kit+CSCs was observed under fluorescence microscope. The transfection efficiency were 80% when MOI was 20. The level of CGRP was significantly increased in Lv-ECFP-CGRP-CSCs group compared with Lv-EGFP-CSCs group and CSCs group (P<0.05). Meanwhile, transfection with lentiviral vector in each group did not affect the viability of c-kit+CSCs. CONCLUSION: Transfection of Lv-EGFP-CGRP into c-kit+CSCs was successful. The secretion of CGRP was found in the transfected c-kit+CSCs and the viability was not changed after transfection. CGRP-modified c-kit+CSCs may play a role in treating myocardial infarction．

Calcitonin gene-related peptide; Lentiviral vector; Cardiac stem cell; Cell viability

1000- 4718(2016)08- 1445- 06

2016- 01- 20

2016- 05- 30

國家自然科學基金資助項目(No. 81360021)；貴州省國際合作項目[黔科合外G字(2013)7037號]

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.018

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