董思敏， 王海璐， 王全凱△， 張 晶△

(1吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118; 2長白山制藥股份有限公司，吉林 吉林 132100)

鹿茸水提物減輕順鉑所致的小鼠腎損傷*

董思敏1,2， 王海璐1， 王全凱1△， 張 晶1△

(1吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118;2長白山制藥股份有限公司，吉林 吉林 132100)

目的： 探討梅花鹿二杠茸和三岔茸水提物對順鉑(CDDP)所致小鼠腎損傷的影響。方法: 采用灌胃給藥方式，用順鉑(15 mg/kg)誘導小鼠腎損傷模型，測定小鼠腎臟指數(shù)(KI)、血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量，并對腎臟組織進行HE染色，觀察腎臟病理學變化，研究梅花鹿二杠茸和三岔茸的水提物各劑量對小鼠腎損傷的影響。結(jié)果: 與順鉑組相比，各劑量鹿茸水提物可顯著降低CDDP誘導腎損傷小鼠SCr、BUN水平及腎臟MDA含量，提高SOD和GSH-Px的活性(P<0.05)；明顯改善腎組織病理學形態(tài)，減輕CDDP對腎小管上皮細胞的損傷程度，且同等濃度下，與三岔茸相比，二杠茸水提物能更好地改善腎功能及減輕病理損傷。結(jié)論: 鹿茸水提物減輕順鉑引起的小鼠腎損傷，其作用機制可能與鹿茸水提物增強小鼠腎臟組織的抗氧化能力有關。

鹿茸水提物； 順鉑； 腎毒性； 抗氧化作用

鹿茸為鹿科動物梅花鹿(CervusnipponTemminck)或馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角?；谷壮蕡A柱狀分枝，具一個分枝者習稱“二杠”，具二個分枝者，習稱“三岔”。鹿茸作為我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，具有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效[1]。

順鉑(cisplatin，CDDP)是臨床化療最常用的藥物之一[2]，但其在腎組織內(nèi)的蓄積可引起腎損傷[3]，其療效與用藥劑量成正比[4]。腎毒理學研究認為CDDP腎損傷主要與氧化應激機制有關[5]，其臨床應用劑量受到限制[6]。據(jù)報道，鹿茸水提物具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫等作用[7]，其是否對CDDP誘導腎損傷有影響則未見報道。本研究旨在比較二杠茸和三岔茸水提物對CDDP腎毒性小鼠腎功能、腎組織形態(tài)學和氧化指標的影響，為鹿茸在CDDP腎毒性治療中的應用提供可靠的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物及實驗材料

64只清潔級健康ICR雄鼠(長春市億斯實驗動物技術有限責任公司)，體重(20±2)g。小鼠室溫飼養(yǎng)，每天更換墊料1次，自由飲食飲水。

梅花鹿二杠茸和三岔茸于2014年采購于吉林省吉云集團鹿產(chǎn)品加工有限責任公司，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院王全凱教授鑒定為梅花鹿(CervusnipponTemminck)茸。將鹿茸粉碎過80目篩，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑及儀器

順鉑(上海思域化工科技有限公司，純度>99%，pt>65%)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum crea-tinine，SCr)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；氯化鈉注射液(吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司)；中性樹膠封片劑(武漢百浩天生物科技有限公司)；高效切片石蠟(上海華永石蠟有限公司)；無水乙醇、甲醛、二甲苯、蘇木素、伊紅，均為分析純。

TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；XSP-BM-8CA生物顯微鏡(上海彼愛姆光學儀器制造有限公司)；石蠟切片機(Leica)；DG5033A型酶聯(lián)免疫檢測儀(北京華運安特科技有限責任公司)；KQ-250DB臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；1 mL無菌注射器配灌胃針頭(江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司)。

3 主要方法

3.1 給藥組溶液的配制 準確稱取二杠茸粉末及三岔茸粉末各10 g，分別置于錐形瓶內(nèi)，以水為溶劑，室溫下超聲提取2次，每次用水100 mL，超聲提取0.5 h，過濾，合并提取液，將提取液冷凍干燥，即得二杠茸水提物和三岔茸水提物。精密稱取2種水提物各1 g、2 g和4 g，分別溶于100 mL水中，即得各樣品的低劑量(low dose, L;100 mg/kg)、中劑量(medium dose, M;200 mg/kg)和高劑量(high dose, H;400 mg/kg)。二杠茸水提物各劑量組分別為DL、DM和DH組；三岔茸水提樣各劑量組分別為TL、TM和TH組。

3.2 CDDP溶液的配制 精密稱取CDDP 31.5 mg溶于21 mL氯化鈉注射液中，配制成1.5 g/L濃度的CDDP溶液，超聲30 min，使其充分溶解，得模型組溶液。

3.3 實驗動物分組及給藥 將實驗動物飼養(yǎng)1周調(diào)節(jié)其適應性，隨機分為8組，每組8只，灌胃(intragastric administration，ig)方式給藥，每次用藥體積均為0.01 mL/g?？瞻讓φ战M(control group，Con)和CDDP組第 1～8天均給予與給藥組等量的生理鹽水，每天1次；給藥組每天按照劑量ig給藥1次，連續(xù)給藥7 d，第8天正常喂養(yǎng)，并于第9天給藥1 h后對給藥組和CDDP組均單次ig CDDP溶液(15 mg/kg)。給予CDDP 72 h后解剖，解剖前12 h對小鼠禁食不禁水，按照給藥、造膜順序依次對各組小鼠進行眼球取血，4 000 r/min離心10 min分離血清，4 ℃保存待檢測主要腎功能指標；沿腹中線迅速解剖，用生理鹽水沖洗腎組織，濾紙吸干，稱重，于10%的甲醛溶液中固定5d，進行HE染色，觀察腎臟組織病理學改變。

3.4 觀察小鼠狀況及指標檢測 每天按照固定時間給藥后稱重，觀察小鼠狀態(tài)、毛色和活動情況，記錄各組小鼠攝食量、飲水量及體重變化，并按照公式：腎臟指數(shù)(kidney index，KI；%)=腎臟重量(g)/體重(g)×100%，計算各組小鼠腎臟指數(shù)。

BUN含量采用脲酶法，SCr含量采用肌氨酸氧化酶法，SOD活性測定采用WST-1法，GSH-Px活性測定采用微量酶標法, MDA含量測定采用TBA法，均嚴格按照試劑盒使用方法進行操作。

3.5 腎組織HE染色 將置于10%的甲醛溶液中固定的左腎臟組織取出，沿冠狀面切成兩半，將4 mm×3 mm×3 mm大小的腎塊置于包埋盒中，經(jīng)流動水沖洗以除去甲醛，按照低濃度至高濃度乙醇脫水，二甲苯透明，置于60 ℃的軟蠟Ⅰ、Ⅱ及硬蠟Ⅰ、Ⅱ，將浸蠟的腎組織放入裝有熔化石蠟的包埋鐵盒內(nèi)，晾干。石蠟切片機切片(片厚5 μm)，于30 ℃水浴鍋內(nèi)展開后于80 ℃烘箱烘烤2 h，再進行HE染色，用中性樹膠封片，于光學顯微鏡(×400)下觀察腎臟組織細胞數(shù)量、形態(tài)、細胞間質(zhì)等腎臟結(jié)構(gòu)病理學改變并攝片。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 小鼠的一般情況

小鼠給予CDDP當天便出現(xiàn)攝食量和飲水量下降、活動量減少、體重減輕、卷曲拱背、精神稍有萎靡、形體消瘦、活動遲緩、毛色失澤等現(xiàn)象，而Con組生長情況良好，飲食正常，反應靈敏，無上述現(xiàn)象。治療組基本無上述現(xiàn)象，諸癥有所減輕，反應較靈敏。

2 鹿茸水提物對CDDP致小鼠腎損傷腎臟指數(shù)影響

腎臟指數(shù)是反映腎臟損傷程度的客觀指標，與Con組相比，CDDP組小鼠腎指數(shù)顯著升高(P<0.05)，體重減輕，腎臟有膨大現(xiàn)象，發(fā)生急性水腫，代謝器官受損嚴重；各給藥組小鼠腎指數(shù)趨于Con組水平而顯著低于CDDP組(P<0.05)。給藥組隨用藥劑量加大，腎指數(shù)依次減小，表現(xiàn)出一定的劑量依賴關系，同等濃度二杠茸水提物對CDDP引起的腎損傷減輕程度明顯優(yōu)于三岔茸水提物，見圖1。

Figure 1.The effect of the aqueous extract of velvet antler on kidney index (KI) of the mice treated with cisplatin. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsCDDP group.

圖1 鹿茸水提物對小鼠腎臟指數(shù)的影響

3 鹿茸水提物對接受CDDP灌胃小鼠BUN和SCr含量的影響

與Con組相比，給予CDDP后，CDDP組小鼠BUN和SCr含量明顯升高(P<0.05)，說明造模成功；各劑量鹿茸水提取物給藥組與CDDP組相比， BUN和SCr的含量均有所下降，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，且存在劑量依賴關系,說明鹿茸水提物能減輕CDDP誘導小鼠急性腎損傷，且同等濃度下二杠茸水提物作用效果優(yōu)于三岔茸水提物，見圖2。

4 鹿茸水提物對接受CDDP灌胃小鼠腎組織中SOD、MDA和GSH-Px的變化

與Con組相比，CDDP組小鼠腎組織中SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)；而各給藥組小鼠腎組織中SOD和GSH-Px活性與CDDP組相比均有所升高，MDA含量有所下降，除DL、TM和TL組外，其余各組的SOD活性與CDDP組相比差異均具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；除TL組外，其余各組的GSH-Px活性與CDDP組相比差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)；各劑量鹿茸水提取物給藥組的MDA含量與CDDP組相比差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，表明二杠茸、三岔茸水提物都能顯著抑制順鉑引起的腎臟組織 SOD、GSH-Px活性下降和MDA 含量升高；且作用強度存在劑量依賴關系，同等濃度下二杠茸水提物作用效果優(yōu)于三岔茸水提物，見圖3。

Figure 2.The effects of the aqueous extract of velvet antler on BUN and SCr levels in the mice treated with CDDP. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsCDDP group.

圖2 鹿茸水提物對CDDP所致小鼠血清BUN、CRE含量的影響

Figure 3.The effects of the aqueous extract of velvet antler on the activitiy of SOD and GSH-Px, and the content of MDA in the mice treated with CDDP. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsCDDP group.

圖3 鹿茸水提物對CDDP所致小鼠腎組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

5 腎組織HE染色觀察

在分別給予生理鹽水、鹿茸水提物或CDDP 72 h后，觀察8組小鼠腎臟組織的病理改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Con組小鼠的腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管排列規(guī)則，腎間質(zhì)及腎小球無充血和炎細胞浸潤；CDDP組與Con組相比則出現(xiàn)大面積壞死區(qū)域，細胞排列疏松、紊亂，刷狀緣消失，部分細胞核消失，腎小管出現(xiàn)明顯的萎縮、擴張，壞死的腎小管上皮細胞明顯增多，腎近曲小管上皮細胞有空泡變性、壞死，胞質(zhì)疏松，局部細胞壞死，管腔可見脫落上皮細胞，腎小管出現(xiàn)蛋白管型，管腔狹窄，出現(xiàn)典型的急性腎損傷病理表現(xiàn)；各劑量鹿茸水提取物給藥組小鼠的腎組織病理損害明顯減輕，隨著鹿茸水提物濃度的增加，腎損傷程度減輕，細胞核明顯增多，聚集現(xiàn)象減輕，細胞排列逐漸規(guī)則，腎小管萎縮程度逐漸減輕，壞死的腎小管上皮細胞明顯減少，空泡變性明顯減少，細胞排列較規(guī)則，胞質(zhì)疏松程度減少，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)逐漸趨于完整，同等濃度二杠茸水提物作用效果優(yōu)于三岔茸水提物，見圖4。

Figure 4.HE staining of the renal tissues in the mice (×400).

圖4 小鼠腎組織HE染色觀察

討 論

中醫(yī)學認為，CDDP腎毒性屬中醫(yī)“藥毒”、“腎虛”范疇。CDDP毒性的本質(zhì)是腎的精氣不足[8]。采用CDDP等腎毒性藥物化療會造成機體組織的損傷[9]，減少腎小球濾過率，升高BUN和SCr水平[10]，引起腎血管收縮、腎功能損害等癥狀；其主要靶位是腎小管上皮細胞[11]，早期往往首先損害腎近曲小管，導致腎小管細胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂等病理改變[12]。西醫(yī)多通過選擇給藥時間、控制給藥速度和改變給藥途徑等方法緩解CDDP腎毒性，下午或者傍晚使用CDDP對腎臟的損傷程度最小，毒性最低，這與機體對藥物的生物處理和反應呈現(xiàn)出的時間依賴性有關[13]。

機體過量產(chǎn)生活性氧被認為是化療藥物毒副作用的根源[14]。通常情況下，SOD可通過歧化作用清除CDDP代謝過程所產(chǎn)生的氧自由基，保護細胞免受超氧化物自由基的損傷[15]。GSH-Px是體內(nèi)重要的保護酶類，在細胞保護酶系統(tǒng)中的作用是清除氧自由基[16]，能特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[17]。脂質(zhì)過氧化主要產(chǎn)物MDA，其含量變化可反映體內(nèi)自由基代謝的異常及脂質(zhì)過氧化速率，因此，MDA含量高低既反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，也間接反映受自由基攻擊致腎損害的嚴重程度[18]。在本實驗中，CDDP組小鼠腎組織中的SOD及GSH-Px活性降低，而MDA含量明顯升高，CDDP促進腎組織脂質(zhì)過氧化形成，使體內(nèi)抗氧化能力降低，體內(nèi)不能清除過多的自由基，從而促進了氧化應激，加重了腎損傷[19]。

鹿茸水提物可通過清除氧自由基、對抗脂質(zhì)過氧化反應來減輕CDDP所致的腎功能損傷，促進腎小管的修復。結(jié)果表明，預先給予鹿茸水提物能顯著抑制CDDP所致的脂質(zhì)過氧化，改善了體內(nèi)的抗氧化能力，減輕了CDDP對腎臟的氧化損傷。鹿茸水提物的抗氧化作用可能是其減輕CDDP所致小鼠腎臟損傷的重要機制，其中所含的多糖和蛋白質(zhì)的抗氧化作用可能也是其增效減毒作用的藥理作用物質(zhì)基礎，且二杠茸水提物的藥效優(yōu)于三岔茸，為梅花鹿茸在臨床上的應用提供了新的理論依據(jù)。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Protective effect of aqueous extract of velvet antler on cisplatin-induced nephrotoxicity in mice

DONG Si-min1,2, WANG Hai-lu1, WANG Quan-kai1, ZHANG Jing1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2ChangbaishanPharmaceuticalCo.Ltd,Jilin132100,China.E-mail:zhjing0701@163.com; 13944125038@163.com)

AIM: To study the protective effect of aqueous extract of 2-branched and 3-branched velvet antler on cisplatin (CDDP)-induced nephrotoxicity in mice. METHODS:The mouse model of renal injury was induced by intragastric administration of CDDP at the dose of 15 mg/kg. After treatment, kidney index (KI), serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), the activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px), and the content of malondialdehyde (MDA) in the kidney were determined. The renal pathological changes were observed with HE staining. RESULTS: Aqueous extract of velvet antler at the tested dose markedly decreased BUN, SCr and the content of MDA, and elevated the activity of SOD and GSH-Px in the mice pretreated with CDDP (P<0.05). The pathological changes of the renal tissues were improved obviously, and the injury of the epithelial cells of renal tubules was mitigated. The effect of the aqueous extract of 2-branched velvet antler on renal function and cisplatin-induced nephrotoxicity was better than that of 3-branched one at the same concentration. CONCLUSION: The aqueous extract of 2-branched and 3-branched velvet antler has a certain protective effect on cisplatin-induced nephrotoxicity, which may be associated with increasing the anti-oxidative capability of mouse renal tissue.

Aqueous extract of velvet antler; Cisplatin; Nephrotoxicity; Anti-oxidation

1000- 4718(2016)08- 1466- 05

2016- 01- 11

2016- 06- 13

吉林省科技計劃發(fā)展項目(No. 20140204063YY； No. 20130102058JC)

R285.5； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.022

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 張晶 Tel： 0431-84533358; E-mail： zhjing0701@163.com; 王全凱Tel： 0431-84533087; E-mail： 13944125038@163.com