徐 明， 楊 洋， 車拴龍， 樸英實(shí)， 林貞花, ， 陳麗艷△

(延邊大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 2腫瘤研究中心，吉林 延吉 133002)

NQO1過表達(dá)在卵巢黏液性囊腺癌預(yù)后評(píng)估中的意義*

徐 明1， 楊 洋1， 車拴龍1， 樸英實(shí)2， 林貞花1, 2， 陳麗艷2△

(延邊大學(xué)1醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，2腫瘤研究中心，吉林 延吉 133002)

目的： 探討NAD(P)H醌氧化還原酶1[NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1，NQO1]過表達(dá)在卵巢黏液性囊腺癌臨床預(yù)后評(píng)估中的意義。方法: 應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測(cè)NQO1蛋白在162例卵巢黏液性囊腺癌組織、35例卵巢黏液性囊腺瘤組織和29例正常卵巢上皮組織中的表達(dá)，并分析其過表達(dá)與卵巢黏液性囊腺癌臨床病理學(xué)特點(diǎn)之間的關(guān)系，通過Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析。結(jié)果: NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中的陽性率及強(qiáng)陽性率分別為85.8%和64.2%，顯著高于卵巢黏液性囊腺瘤和正常卵巢上皮組織(P<0.01)?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，NQO1蛋白高表達(dá)與卵巢黏液性囊腺癌組織學(xué)分級(jí)和FIGO分期密切相關(guān)(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，NQO1蛋白高表達(dá)的卵巢黏液性囊腺癌患者總生存期和無病生存期均明顯低于NQO1蛋白低表達(dá)患者。結(jié)論: NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中呈高表達(dá)，可能成為卵巢黏液性囊腺癌預(yù)后評(píng)估的有效生物學(xué)指標(biāo)。

卵巢黏液性囊腺癌； NAD(P)H醌氧化還原酶1； 免疫組化； 無病生存期； 預(yù)后

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，種類較多。其中，卵巢黏液性囊腺癌是常見類型，發(fā)病率僅次于卵巢漿液性囊腺癌，但其5年生存期僅為30%左右[1]，嚴(yán)重威脅婦女的生命健康[2]。由于卵巢黏液性囊腺癌生長部位隱蔽，肉眼觀察不到，早期臨床癥狀與炎癥相似，體征不明顯，確診時(shí)多已發(fā)展為晚期，故其生存期短且預(yù)后差。因此，探討卵巢黏液性囊腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找其早期診斷和預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)極為重要。

NAD(P)H醌氧化還原酶1[NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1，NQO1]以NAD(P)H為受體，催化醌類及其衍生物，避免其損傷細(xì)胞并保護(hù)機(jī)體免受致癌物影響[3]。有研究表明，NQO1蛋白在結(jié)直腸癌[3]、腎透明細(xì)胞癌[4]、肺癌組織[5]、子宮頸癌[6]、浸潤性卵巢癌[7]、胰腺癌[8]等多種惡性腫瘤異常表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但目前尚未見NQO1蛋白與卵巢黏液性囊腺癌的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究旨在應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測(cè)NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中的表達(dá)情況，探討NQO1蛋白表達(dá)檢測(cè)在卵巢黏液性囊腺癌中的臨床病理學(xué)意義及其與患者生存期的關(guān)系，為卵巢黏液性囊腺癌預(yù)后評(píng)估提供新的分子指標(biāo)。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

臨床資料齊全的卵巢組織標(biāo)本選自2000年1月～2010年12月延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤組織庫和延邊婦幼保健院病理科。其中包括162例卵巢黏液性囊腺癌、35例卵巢黏液性囊腺瘤組織和29例正常卵巢上皮組織。162例卵巢黏液性囊腺癌患者中，年齡≥48歲的有98例，<48歲的有64例。根據(jù)國際婦科學(xué)會(huì)(FIGO)2014年修訂的卵巢癌分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)卵巢癌進(jìn)行臨床分期，其中FIGO I-II期(早期)有93例，F(xiàn)IGO III-IV期(晚期)有69例。所有患者在術(shù)前均未接受放療或化療，患者隨訪均超過5年，平均生存時(shí)間為48.4個(gè)月，五年生存率為32.7%。

2 方法

免疫組化EnVision法檢測(cè)試劑盒為Dako產(chǎn)品；NQO1鼠抗人單克隆抗體購自Santa Cruz。染色步驟為常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)，加入 I 抗(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜；次日滴加 II 抗，DAB顯色，Mayer蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。為了證明NQO1蛋白抗體免疫組化檢測(cè)的特異性，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了鼠IgG代替 I 抗作為對(duì)照，結(jié)果為陰性。同時(shí)，選擇NQO1蛋白陽性染色的切片，以PBS代替 I 抗染色的結(jié)果為陰性，以此作為結(jié)果可信的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化染色結(jié)果以雙評(píng)分半定量法進(jìn)行判定。將有棕黃色顆粒在細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)視為陽性。按染色強(qiáng)度，無著色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；每張切片在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分級(jí)，陽性細(xì)胞數(shù)占0%～5%的記為0分，陽性細(xì)胞數(shù)占5%～25%的記為1分，陽性細(xì)胞數(shù)占26%～50%的記為2分，陽性細(xì)胞數(shù)占50%～75%的記為3分，陽性細(xì)胞數(shù)>75%的記為4分。最后將兩項(xiàng)計(jì)分結(jié)果相乘，0分記為“-”，1～4分記為“+”，5～8分記為“++”，9～12分記為“+++”。陽性率是“+”、“++”和“+++”的病例數(shù)占總病例數(shù)的百分比；強(qiáng)陽性率是“++”和“+++”的病例數(shù)占總病例數(shù)的百分比。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間NQO1蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)差異分析采用2檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中過表達(dá)

NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌組織中主要呈現(xiàn)細(xì)胞漿表達(dá)，少量細(xì)胞核表達(dá)。NQO1蛋白在29例正常卵巢上皮組織中僅有3例呈現(xiàn)強(qiáng)陽性，陽性率是37.9%，強(qiáng)陽性率是10.3%；在162例卵巢黏液性囊腺癌組織中的陽性率和強(qiáng)陽性率分別是85.8%和64.2%；在卵巢黏液性囊腺瘤組織中的陽性率和強(qiáng)陽性率分別為60.0%和42.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1、表1。

2 NQO1蛋白過表達(dá)與卵巢黏液性囊腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

NQO1蛋白高表達(dá)與卵巢黏液性囊腺癌的組織學(xué)分級(jí)和FIGO分級(jí)密切相關(guān)(P<0.05)，但是與患者的年齡和絕經(jīng)狀態(tài)不相關(guān)。NQO1蛋白在組織學(xué)分級(jí)2級(jí)和3級(jí)中的表達(dá)明顯高于1級(jí)；而且在FIGO分級(jí)III～I(xiàn)V期(晚期)中NQO1蛋白高表達(dá)占95.7%，明顯高于I～I(xiàn)I期(早期)，見表2。

Figure 1.IHC staining of NQO1 protein in ovarian samples (×400). A: weakly positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenoma; B: positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenocarcinoma; C: strongly positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenocarcinoma, which was mainly located in cytoplasm and gathered around the nucleus.

圖1 NQO1蛋白在卵巢組織中的表達(dá)

表1 NQO1蛋白在各組卵巢病變組織中的表達(dá)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal ovarian epithelium;#P<0.01vsovarian mucinous cystadenoma.

表2 NQO1蛋白過表達(dá)與卵巢黏液性囊腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 NQO1蛋白過表達(dá)與卵巢黏液性囊腺癌患者生存期之間的關(guān)系

應(yīng)用Kaplan-Meier方法分析162例卵巢黏液性囊腺癌的生存期與NQO1蛋白的關(guān)系，繪制生存曲線顯示，NQO1蛋白高表達(dá)的卵巢黏液性囊腺癌患者的總生存期和無瘤生存期均明顯低于NQO1蛋白低表達(dá)者(P<0.01)，見圖2，提示NQO1蛋白對(duì)卵巢黏液性囊腺癌患者生存期有顯著影響。

討 論

卵巢黏液性囊腺癌嚴(yán)重影響女性患者的生活質(zhì)量，由于缺乏對(duì)卵巢黏液性囊腺癌的有效早期診斷以及分子治療靶點(diǎn)的識(shí)別，晚期卵巢黏液性囊腺癌患者的5年死亡率一直居高不下。因此，發(fā)現(xiàn)有效的卵巢黏液性囊腺癌早期診斷以及預(yù)后評(píng)估分子標(biāo)志物，對(duì)提高患者生存率具有重要意義。

Figure 2. Kaplan-Meier survival curves illustrated the significance of NQO1 expression in ovarian mucinous cystadenocarcinoma. A: the correlation between NQO1 expression and overall survival rate; B: the correlation between NQO1 expression and disease-free survival rate.

圖2 NQO1表達(dá)與卵巢黏液性囊腺癌患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存曲線

NQO1蛋白是一類普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)的黃素蛋白酶，可為細(xì)胞提供多層次的氧化應(yīng)激保護(hù)，包括高活性的醌類解毒、維護(hù)脂溶性抗氧化劑減少、穩(wěn)定抑癌基因p53等[9-10]。NQO1基因位于人染色體16 q21～22區(qū)段，研究發(fā)現(xiàn)，其C609T位點(diǎn)易發(fā)生基因突變，可使機(jī)體重要的細(xì)胞防御機(jī)制無法抵抗光譜毒性物質(zhì)及醌類衍生物對(duì)機(jī)體的致癌作用和其它毒性作用[11]。代恩勇等[12]應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段多態(tài)性(PCR-RFLP)基因型分析技術(shù)對(duì)NQO1 cDNA 609位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果證實(shí)NQO1基因多態(tài)性與大腸癌的發(fā)生有一定相關(guān)性。Fagerholm等[13]研究也提示NQO1基因表型可視為乳腺癌預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志。這可能是由于NQO1多態(tài)性導(dǎo)致黃素蛋白酶活性降低甚至失活，從而減弱或者喪失NQO1對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，增加了個(gè)體患腫瘤的可能性。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NQO1蛋白在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過免疫組化的方法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)出NQO1在腎透明細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[4]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常癌旁組織和卵巢黏液性囊腺瘤相比，卵巢黏液性囊腺癌中NQO1蛋白的陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)明顯升高，且NQO1蛋白的表達(dá)與卵巢黏液性囊腺癌的組織學(xué)分級(jí)和FIGO分級(jí)顯著相關(guān)；結(jié)果還顯示隨著卵巢黏液性囊腺瘤惡性程度的增高，NQO1蛋白的表達(dá)也異常增高，以上均提示NQO1蛋白的表達(dá)可能在卵巢黏液性囊腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，NQO1蛋白在惡性腫瘤中高表達(dá)的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

本課題組的前期研究表明，NQO1蛋白在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，是結(jié)直腸癌的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子[3]；此外，通過Kaplan-Meier生存分析的結(jié)果表明，NQO1對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者生存期有顯著影響[14]。Awadallah等[15]在胰腺導(dǎo)管腺癌中發(fā)現(xiàn)標(biāo)記NQO1蛋白可以成為有用的臨床治療預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo)。在本研究中，通過生存分析發(fā)現(xiàn)，卵巢黏液性囊腺癌患者NQO1蛋白高表達(dá)組的總生存期和無病生存期與低表達(dá)組相比顯著降低，提示NQO1參與卵巢黏液性囊腺癌的進(jìn)展，并可作為有效的預(yù)后評(píng)定指標(biāo)之一。

綜上所述，NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌中表達(dá)明顯上調(diào)，為臨床上卵巢黏液性囊腺癌的預(yù)后判定提供了可能的理論依據(jù)。NQO1蛋白有期望成為臨床上卵巢黏液性囊腺癌的預(yù)后指標(biāo)和潛在的分子靶向治療目標(biāo)。

[1] Sant M, Aareleid T, Berfino F, et al. EUROCARE-3: survival of cancer patients diagnosed 1990-94: results and commentary[J]. Ann Oncol, 2003, 14(Suppl 5):v61-v118.

[2] 賀立彩，陳 尚，朱真鋒，等. Ikaros的3種亞型對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(8):1407-1411.

[3] 馬 躍，林黎娟，樸俊杰，等. 結(jié)直腸癌中NQO1蛋白表達(dá)的臨床病理及預(yù)后意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2008, 30(4):366-370.

[4] 高 強(qiáng)，許 鵬，郭巖松，等. Nrf2、NQO1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 35(4):421-423.

[5] 倪 靜，秦麗娟，吳擁軍，等. 肺癌組織中Nrf2、Keap1和NQO1蛋白的表達(dá)[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2012, 47(4):456-459.

[6] Ma Y, Kong JN, Yan GH, et al. NQO1 overexpression is associated with poor prognosis in squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J]. BMC Cancer, 2014, 14:414.

[7] Cui XL, Li LH, Yan GH, et al. High expression of NQO1 is associated with poor prognosis in serous ovarian carcinoma[J]. BMC Cancer, 2015, 15:244.

[8] Awadallah NS, Dehn D, Shah RJ, et al. NQO1 expression in pancreatic cancer and its protential use as a biomarker[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2008, 16(1):24-31.

[9] Nioi P, Hayes JD. Contribution of NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 to protection against carcinogenesis, and regulation of its gene by the Nrf2 basic-region leucine zipper and the arylhydrocarbon receptor basic helix-loophelix transcription factors[J]. Mutat Res, 2004, 555(1-2):149-171.

[10]Girolami F, Abbadessa G, Racca S, et al. Time-depen-dent acetylsalicylic acid effects on liver CYP1A and antioxidant enzymes in a rat model of 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA)-induced mammary carcinogenesis[J]. Toxicol Lett, 2008, 181(2):87-92.

[11]Tsai CW, Lin CY, Wang YJ. Carnosic acid induces the NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 expression in rat clone 9 cells through the p38/nuclear factor erythroid-2 related factor 2 pathway[J]. J Nutr, 2011, 141(12):2119-2535.

[12]代恩勇，盧振霞，史潔萍，等.NQO1基因多態(tài)性與大腸癌遺傳易感性[J]. 中國腫瘤臨床, 2004, 31(2):89-91.

[13]Fagerholm R, Hofstetter B, Tommiska J, et al. NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 NQO1*2 genotype (P187S) is a strong prognostic and predictive factor in breast cancer[J]. Nat Genet, 2008, 40(7):844-853.

[14]楊 洋，金鐵峰，劉雙萍，等. 醌氧化還原酶過表達(dá)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后評(píng)估中的意義[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2014, 43(7):463-467.

[15] Awadallah NS, Dehn D, Shah RJ, et al. NQO1 expression in pancreatic cancer and its potential use as a biomarker[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2008, 16(1):24-31.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Prognostic significance of NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 overexpression in ovarian mucinous cystadenocarcinoma

XU Ming1, YANG Yang1, CHE Shuan-long1, PIAO Ying-shi2, LIN Zhen-hua1,2, CHEN Li-yan2

(1DepartmentofPathology，MedicalCollege,2CancerResearchCenter,YanbianUniversity,Yanji133002,China.E-mail:lychen@ybu.edu.cn)

AIM: To investigate the significance of NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 (NQO1) protein overexpression for prognostic evaluation of ovarian mucinous cystadenocarcinoma.METHODS: NQO1 protein was detected in 162 cases of ovarian mucinous cystadenocarcinoma, 35 cases of ovarian mucinous cystadenoma and 29 samples of normal ovarian epithelial tissues by the method of EnVision immunohistochemical staining. The correlation between high expression of NQO1 protein and clinicopathological features of ovarian mucinous cystadenocarcinoma was also evaluated. Overall survival and disease-free survival rates of ovarian mucinous cystadenocarcinoma patients were calculated by Kaplan-Meier method. RESULTS: The positive rate and strongly positive rate of NQO1 protein were 85.8% and 64.2% in ovarian mucinous cystadenocarcinoma, respectively, which are significantly higher than those in ovarian mucinous cystadenoma, and normal ovarian epithelial tissues (P<0.01). NQO1 expression was significantly correlated with the histological grade (P<0.05) and clinical stage (P<0.01) of ovarian mucinous cystadenocarcinoma. Kaplan-Meier survival analysis showed that the overall survival rate and disease-free survival rate were significantly higher in ovarian mucinous cystadenocarcinoma patients with high NQO1 expression than those with low NQO1 expression (P<0.01).CONCLUSION: NQO1 expression is closely correlated with the progression and prognosis of the patients with ovarian mucinous cystadenocarcinoma. High expression of NQO1 protein may be used as an important indicator for the patients with poor prognosis of ovarian mucinous cystadenocarcinoma.

Ovarian mucinous cystadenocarcinoma; NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1; Immunohistochemistry; Disease-free survival; Prognosis

1000- 4718(2016)08- 1461- 05

2016- 03- 03

2016- 06- 15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81460399)

R730.23； R737.31

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.021

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