張翔，張效偉，楊江華，周?chē)?guó)棟

(1. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210000；2. 江蘇省環(huán)境保護(hù)水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213001；3. 常州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 常州 213001)

應(yīng)用物種DNA條形碼識(shí)別太湖流域部分底棲無(wú)脊椎動(dòng)物種類(lèi)

張翔1，2，3，張效偉1*，楊江華1，周?chē)?guó)棟2，3

(1. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210000；2. 江蘇省環(huán)境保護(hù)水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213001；3. 常州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 常州 213001)

將物種DNA條形碼實(shí)際應(yīng)用于太湖流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物分類(lèi)，并與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果比對(duì)，結(jié)果表明，DNA條形碼技術(shù)可應(yīng)用于本流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物分類(lèi)，但現(xiàn)階段無(wú)法替代形態(tài)學(xué)鑒定，主要原因是太湖流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的絕大多數(shù)物種COⅠ基因特征序列是未知的或是BLAST所擁有的分類(lèi)程度不夠，提出在今后的研究中應(yīng)探索建立太湖流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物COⅠ基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

太湖流域；底棲無(wú)脊椎動(dòng)物；DNA條形碼；形態(tài)學(xué)分類(lèi)

底棲無(wú)脊椎動(dòng)物作為常用的水質(zhì)指示生物之一[1]，因傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)鑒定的局限和傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)家隊(duì)伍的縮減[2]，使得其用作水質(zhì)生物生態(tài)監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)的推廣有一定難度。2009年，第57屆北美底棲生物學(xué)協(xié)會(huì)(NABS)年度會(huì)議中總結(jié)了DNA條形碼技術(shù)對(duì)底棲生物研究的貢獻(xiàn)，并在底棲生物科學(xué)家之中進(jìn)行推廣，使該技術(shù)得到大面積的使用[3]。在我國(guó)，目前該技術(shù)以植物、昆蟲(chóng)和水生動(dòng)物的研究為主流[4]，在水生動(dòng)物研究中，尤以海洋動(dòng)物為主[5]。在淡水底棲無(wú)脊椎動(dòng)物方面，除水生昆蟲(chóng)外，國(guó)內(nèi)研究報(bào)道較少，但甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物均有所涉及：2006年楊學(xué)明等[6]對(duì)羅氏沼蝦3個(gè)群體線(xiàn)粒體COⅠ基因的序列差異和遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究報(bào)道；2007年關(guān)飛等[7]對(duì)中國(guó)不同種擬釘螺COⅠ基因的序列差異及其系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行研究報(bào)道；2008年黃曉燕等[8]對(duì)5種螺螄屬動(dòng)物和中國(guó)圓田螺COⅠ基因序列進(jìn)行研究報(bào)道；2012年焦明超[9]對(duì)環(huán)棱螺屬部分種類(lèi)DNA條形碼及其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究報(bào)道；2015年歐陽(yáng)解秀等[10]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)鄱陽(yáng)湖和贛江的中國(guó)淡水蚌類(lèi)進(jìn)行研究報(bào)道。

現(xiàn)嘗試選取太湖流域最具代表性的底棲無(wú)脊椎動(dòng)物，使用DNA條形碼技術(shù)分析COⅠ基因，并與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果比較，探索DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于本流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物鑒定的可行性和實(shí)用性，為推進(jìn)淡水生物監(jiān)測(cè)方法做出探索。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

1.1.1 樣品采集

按照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)5.1.3的要求，于2013年8月—2014年5月在太湖流域采集樣品，點(diǎn)位包括太湖流域上游水系的溪流與水庫(kù)，下游水系的湖蕩與河流，共10個(gè)代表點(diǎn)位，見(jiàn)圖1。

圖1 樣品采集點(diǎn)位

1.1.2 樣品鑒定和保存

樣品采集、挑揀后固定于80%乙醇溶液中，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類(lèi)鑒定，鑒定完成后將已鑒定樣品置于99.99%乙醇溶液中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)解剖選取

在鑒定后保存的樣品中挑選個(gè)體完整度高，動(dòng)物體表無(wú)大量雜質(zhì)的個(gè)體，用Nikon SMZ18研究級(jí)體視顯微鏡拍照留存圖像資料。使用無(wú)菌剪、無(wú)菌手術(shù)刀片獲取動(dòng)物組織：昆蟲(chóng)、甲殼動(dòng)物取足部，環(huán)節(jié)動(dòng)物、軟體動(dòng)物、扁形動(dòng)物取身體軟組織(避開(kāi)消化道)，如個(gè)體實(shí)在太小(如部分搖蚊幼蟲(chóng))，則選取完整個(gè)體，用純水和75%乙醇溶液分別清洗取出的身體組織約0.005 0 g，保證無(wú)雜質(zhì)、無(wú)污染。

1.2.2 DNA提取

研究使用一種改良的HotSHOT[11]快速方法：取得的動(dòng)物組織裝入潔凈的玻璃十字柄組織研磨器中加入10 μL堿性裂解液(NaOH 25 mmol/L、EDTA二鈉0.2 mmol/L，pH值=8.0)研磨，將研磨所得液體加入0.2 mL離心管中，再添加20 μL堿性裂解液。離心管均在95 ℃孵育30 min，并貯存于冰上3～5 min。每根離心管加入30 μL Neutralizing Buffer緩沖液[12]，離心后取上清液。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物電泳

PCR擴(kuò)增體系最終體積為50 μL，其中包括引物1 μL，濃度為10 μmol/L ，超純水37.8 μL，10×PCR High Fidelity PCR buffer 5 μL，50 mmol/L MgSO42 μL，10 mmol/L dNTP mix 1 μL，Platinum Taq DNA聚合酶 0.2 μL，DNA模板2 μL。引物見(jiàn)表1。

表1 引物

將裝有樣品的96孔板置于SureCycler 8800熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，為降低非特異性擴(kuò)增率，進(jìn)行了16個(gè)初始周期如下：95 ℃ 10 s變性、62 ℃(每個(gè)周期降低1 ℃)30 s退火，72 ℃ 60 s延伸，25個(gè)循環(huán)退火至46 ℃；72 ℃ 10 min后延伸。實(shí)驗(yàn)包含一個(gè)不含DNA模板的陰性對(duì)照。

1.2.4 基因序列測(cè)定

為保證每個(gè)樣品測(cè)序均勻，擴(kuò)增產(chǎn)物在等分子質(zhì)量、等質(zhì)量濃度(10 mg/L)條件下混合。使用Ion Plus fragment library kit試劑盒將100 ng的擴(kuò)增產(chǎn)物在79 μL無(wú)核酸酶水中進(jìn)行末端修飾和片段銜接。用Agencourt AMPure XP kit試劑盒，純化末端和銜接片段DNA、去除引物二聚體和小于100 bp的PCR產(chǎn)物。純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物庫(kù)轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL Eppendorf LoBind管中，用Agilent 2100 bioanalyzer儀器檢測(cè)其DNA濃度和分布區(qū)域。

將已定量且大小適中的擴(kuò)增產(chǎn)物庫(kù)(467 bp， 包括擴(kuò)增引物，MID標(biāo)簽，Ion Torrent銜接片段)連續(xù)稀釋至終濃度為26 pmol/L，用Ion PGM template OT2 400 kit試劑盒附加到 ISPs表面。ISPs在Ion OneTouch富集體系中富集，使用Ion PGM sequencing 400 kit試劑盒、Ion Torrent PGM試劑盒、“318 v2”微型芯片測(cè)序。本研究測(cè)序交由Life technologies 中國(guó)公司于上海完成。

1.2.5 基因序列分析

用Bio-Linux 8系統(tǒng)處理所得到的基因序列，去除低質(zhì)量的末端序列與引物序列，并進(jìn)行序列組裝，將組裝完成的序列保存為.fasta格式；使用R語(yǔ)言軟件中“Biostrings”軟件包和“Bioconductor environment ”組件去除少于150 bp的片段，同時(shí)由于COⅠ基因片段在氨基酸水平上高度保守，故未正確編碼氨基酸的非功能性序列也被去除。

在NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)GenBank進(jìn)行在線(xiàn)BLAST比對(duì)。剔除BLAST后比對(duì)出的同一樣品中序列極少的DNA片段。將樣品名稱(chēng)、圖片資料和BLAST后獲得的物種比對(duì)分析、保存。

2 結(jié)果分析

2.1 樣品分類(lèi)

共選取13個(gè)底棲無(wú)脊椎動(dòng)物種類(lèi)，制成13×2份動(dòng)物樣品，供COⅠ基因提取(表2)。

2.2 基因組測(cè)序及在線(xiàn)BLAST結(jié)果

使用新一代DNA條形碼技術(shù)測(cè)定基因組，共獲取98條COⅠ基因序列。經(jīng)分析軟件去除雜帶和引物，剩下的核苷酸片段長(zhǎng)度為15～2 761 bp。在13個(gè)物種中均獲得基因序列，10個(gè)物種的基因序列為有價(jià)值基因序列(表3)。

表3 不同物種在線(xiàn)BLAST結(jié)果

續(xù)表

①比對(duì)獲得的基因序列長(zhǎng)度<200 bp，因可信度不高，不進(jìn)行DNA條形碼技術(shù)與形態(tài)學(xué)鑒定比對(duì)。

2.3 DNA條形碼技術(shù)與形態(tài)學(xué)鑒定比對(duì)

研究表明，用DNA條形碼技術(shù)與形態(tài)學(xué)鑒定均可對(duì)同一樣品進(jìn)行分辨，但各有優(yōu)劣，其中：DNA條形碼技術(shù)鑒定樣品有4個(gè)與形態(tài)學(xué)鑒定樣品相同，可修正和細(xì)化4個(gè)形態(tài)學(xué)鑒定樣品，有1個(gè)分類(lèi)程度不如形態(tài)學(xué)鑒定樣品，有1個(gè)樣品存疑(表4)。

表4 DNA條形碼技術(shù)識(shí)別與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果比對(duì)

續(xù)表

(1)復(fù)檢A84號(hào)樣品，背瘤麗蚌與洞穴麗蚌同屬小方蚌亞科(Ambleminae)麗蚌屬(Lamprotula)，且為姐妹種[14]，洞穴麗蚌為我國(guó)特有種。在本實(shí)驗(yàn)中因DNA條形碼識(shí)別相似度為100%，故予以更改形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。形態(tài)學(xué)鑒定關(guān)鍵為對(duì)洞穴麗蚌的洞穴判定：兩殼面對(duì)應(yīng)的凹凸，即在一殼為凹，另一殼相應(yīng)位置為凸。但在實(shí)際操作中，因其深、淺情況個(gè)體間差異大，故辨識(shí)較困難[15]，而使鑒定出現(xiàn)一些偏差；

(2)復(fù)檢A10號(hào)樣品，軟鋏小搖蚊與多巴小搖蚊同屬于搖蚊亞科(Chironominae)搖蚊族(Chironomini)小搖蚊屬(Microchironomus)，其中多巴小搖蚊2006年由閆春財(cái)?shù)萚16]于中國(guó)首次記錄，軟鋏小搖蚊為世界廣布種，在本實(shí)驗(yàn)中因DNA條形碼識(shí)別相似度為98.65%，故予以更改形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。首先確定A10號(hào)樣品與上傳至NCBI GenBank的物種樣品為同一物種，但復(fù)檢后發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)鑒定關(guān)鍵描述仍存在一定的模糊，并未制作翔實(shí)的檢索表，在今后可予以完善；

(3)復(fù)檢A34號(hào)樣品，蠓科一種與搖蚊科一種兩科同屬于昆蟲(chóng)綱(Insecta)雙翅目(Diptera)，經(jīng)檢索資料[17]及參考樣品查找，形態(tài)學(xué)鑒定應(yīng)無(wú)錯(cuò)，故此處存疑；

(4)復(fù)檢A53號(hào)樣品，形態(tài)學(xué)鑒定的扁(舌)蛭科一種分類(lèi)程度包含了白舌蛭，但形態(tài)學(xué)鑒定人員水平所限，DNA條形碼細(xì)化了分類(lèi)程度，查閱相關(guān)資料后采納DNA條形碼技術(shù)提供的細(xì)化結(jié)果；

(5)復(fù)檢A25號(hào)樣品，霍普水絲蚓屬于寡毛綱一種，DNA條形碼識(shí)別因受制于本流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物COⅠ基因庫(kù)不完善，故分類(lèi)程度不如形態(tài)學(xué)鑒定，因此DNA條形碼識(shí)別需細(xì)化；

(6)復(fù)檢A81號(hào)樣品，方形環(huán)棱螺與銅銹環(huán)棱螺同為環(huán)棱螺屬(Bellamya)，在樣品固定后，形態(tài)學(xué)鑒定僅能依據(jù)體螺層的膨脹度來(lái)判別，因描述抽象且鑒定人員水平所限，在實(shí)際工作中常有混淆，DNA條形碼在基因?qū)用嫔咸峁┝俗R(shí)別條件[9]，故采納DNA條形碼技術(shù)提供的結(jié)果。

3 討論與展望

研究表明DNA條形碼技術(shù)可應(yīng)用于太湖流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物鑒定。但現(xiàn)階段無(wú)法替代形態(tài)學(xué)鑒定，主要原因是太湖流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物絕大多數(shù)物種的COⅠ基因特征序列是未知的或是BLAST所擁有的分類(lèi)程度不夠，故將在今后的研究中探索建立太湖流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物COⅠ基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

DNA條形碼技術(shù)可以鑒定已知物種，識(shí)別未知物種，發(fā)現(xiàn)目前形態(tài)學(xué)鑒定物種出現(xiàn)的模糊區(qū)域，但不應(yīng)完全取代形態(tài)學(xué)鑒定[18]。因?yàn)樵趯?shí)際應(yīng)用中會(huì)遇到一些問(wèn)題：

(1)對(duì)于未知物種只能識(shí)別，無(wú)法精確鑒定其分類(lèi)地位；

(2)無(wú)法明晰物種存活與否，因?yàn)樘饔蛏锼墉h(huán)境變化影響劇烈，物種演替變化較快，使用DNA條形碼技術(shù)鑒定采樣點(diǎn)位物種時(shí)，會(huì)因生物死亡未分解而殘留該生物DNA，使得鑒定數(shù)據(jù)雜糅，不能很好地支撐生態(tài)評(píng)估和政策決斷；

(3)太湖流域底棲無(wú)脊椎動(dòng)物COⅠ基因數(shù)據(jù)庫(kù)尚未建立，且之前所有結(jié)果均依賴(lài)于形態(tài)學(xué)鑒定，如何得到精準(zhǔn)而有延續(xù)的數(shù)據(jù)也是在將來(lái)需要探討的。因?yàn)閺膶?shí)驗(yàn)室到業(yè)務(wù)工作均要求更準(zhǔn)確、實(shí)用的數(shù)據(jù)，所以將來(lái)應(yīng)將形態(tài)學(xué)鑒定與DNA條形碼技術(shù)互相結(jié)合，獲得兩者印證的結(jié)論再予以使用。

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欄目編輯 周立平

Applying DNA Barcoding for Identification of Some Invertebrate Macrozoobenthos at Taihu Lake Basin

ZHANG Xiang1，2，3，ZHANG Xiao-wei1*， YANG Jiang-hua1，ZHOU Guo-dong2，3

(1.SchoolofEnvironment，NanjingUniversity，Nanjing，Jiangsu210000，China； 2.JiangsuEnvironmentalProtectionKeyLaboratoryforAquaticBiomonitoring，Changzhou，Jiangsu213001，China； 3.ChangzhouEnvironmentalMonitoringCenter，Changzhou，Jiangsu213001，China)

DNA barcoding was applied for identification of invertebrate macrozoobenthos at Taihu Lake basin and the results were compared with those obtained from morphological classification. The results demonstrated that DNA barcoding could be applied to classify invertebrate macrozoobenthos at the basin， but at this stage could not replace morphological classification. The main reason was that there were unknown COI characteristic gene sequences for most of the invertebrate macrozoobenthos species or that the degree of classification was not enough for BLAST. It was proposed to explore and establish the gene data bank for invertebrate macrozoobenthos at Taihu Lake basin in future studies.

Taihu Lake basin； Invertebrate macrozoobenthos； DNA barcoding；Morphological classification

2016-03-17；

2016-03-25

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2012ZX07506-003)

張翔(1985—)，男，工程師， 本科，從事水生生物學(xué)監(jiān)測(cè)工作。

X835

B

1674-6732(2016)06-0018-04