邱睿睿，周永健，聶玉強(qiáng)，杜艷蕾，李瑜元

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一醫(yī)院，廣東 廣州 510180

論著·肝臟疾病

NAFLD發(fā)病中基因FXR對PPAR-α影響的實(shí)驗(yàn)研究

邱睿睿，周永健，聶玉強(qiáng)，杜艷蕾，李瑜元

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一醫(yī)院，廣東 廣州 510180

目的 觀察法尼基衍生物X受體(FXR)在非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病過程中對過氧化物酶體增殖物活化受體-α(PPAR-α)表達(dá)的影響。方法 將正常小鼠與FXR基因敲除小鼠分成4組，分別喂高脂飼料及普通飼料，檢測各組小鼠血清ALT、TC、TG，觀察肝臟脂肪變性情況，檢測肝臟PPAR-α mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 模型組血清指標(biāo)均較實(shí)驗(yàn)組顯著升高(P<0.05)，肝臟HE染色見肝臟內(nèi)有大量脂肪滴，部分可見炎癥細(xì)胞聚集，PPAR-α mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 FXR基因功能缺陷可能通過上調(diào)PPAR-α的表達(dá)并改變其在脂質(zhì)代謝中的功能而引起NAFLD的發(fā)生。

非酒精性脂肪性肝??；法尼基衍生物X受體；過氧化物酶體增殖物活化受體-α

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的脂肪性肝病[1-2]。而近年來，越來越多的研究[3]證明NAFLD的發(fā)病機(jī)制與代謝性核受體有著密不可分的關(guān)系。

核受體是一組調(diào)節(jié)復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)活性的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在真核細(xì)胞的發(fā)育、分化、能量代謝平衡等方面發(fā)揮了重要作用。與肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的孤兒核受體主要包括PPARs(過氧化物酶體增殖物活化受體家族)、FXR(法尼基衍生物X受體)、LXR(肝X受體)、RXR(類視黃醇X受體)。其中，膽汁酸是FXR的內(nèi)源性配體，主要通過CYP7A1、Ntcp、Bsep等重要的靶基因?qū)δ懼岬暮铣膳c轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行調(diào)節(jié)[4]，還可以通過抑制PCSK9的活動(dòng)從而減少血漿中膽固醇的濃度[5]，對于血脂代謝的調(diào)節(jié)也具有一定的作用。既往在NAFLD患者中曾發(fā)現(xiàn)FXR的表達(dá)顯著降低[6]，激活FXR以后可以改善高脂血癥、2型糖尿病及脂肪性肝炎[7]。

PPARs主要功能是調(diào)控體內(nèi)脂質(zhì)代謝。肝內(nèi)PPAR-α的主要作用是促進(jìn)肝內(nèi)脂肪酸β氧化，通過誘導(dǎo)脂酰輔酶A合成酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1等減少肝臟甘油三酯的沉積[8]。既往有研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者肝臟PPAR-α mRNA表達(dá)降低[9]。在PPAR-α基因敲除的小鼠體內(nèi)可檢測到血脂代謝紊亂，從而導(dǎo)致了NAFLD發(fā)生[10]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠中胰島素抵抗的表現(xiàn)較PPAR-α基因敲除小鼠明顯[11]，且在高齡的NAFLD大鼠中檢測到PPAR-α的表達(dá)較正常大鼠明顯升高[12]。

在膽汁淤積孕鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR表達(dá)明顯升高但PPAR-α的表達(dá)卻下降[13]。而在新鮮的人類皮脂腺中，能夠檢測到PPAR-α的表達(dá)卻檢測不到FXR的表達(dá)[14]，說明在一些肝臟疾病或脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病中FXR與PPAR-α的表達(dá)可能具有相關(guān)性，但是二者在NAFLD的發(fā)病中是否有著相互關(guān)系則還有待研究，因此本實(shí)驗(yàn)將檢測FXR在NAFLD的發(fā)病過程中是否會(huì)對PPAR-α的表達(dá)產(chǎn)生影響，以了解上述兩種因素是否具有相關(guān)性，為今后的臨床診治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 2個(gè)月齡FXR基因敲除C57/BL小鼠由上海中醫(yī)藥大學(xué)提供(引自美國國家衛(wèi)生研究所)，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。正常2個(gè)月齡野生型C57/BL小鼠及高脂飼料(按質(zhì)量構(gòu)成比由普通級飼料82.5%，豬油10%，蔗糖5%，膽固醇2%，膽鹽0.3%，丙硫氧嘧啶0.2%配制而成)[15]購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。組織RNA提取試劑盒(TaKaRa RNA Extraction Kit)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ)均購自大連寶生物工程TaKaRa有限公司。組織蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PPAR-α一抗購自美國SANTA CRUZ生物有限公司，二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，內(nèi)參抗體GAPDH購自杭州賢至生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組 正常2個(gè)月齡野生型C57/BL小鼠16只(對照組8只、實(shí)驗(yàn)組8只)和2個(gè)月齡FXR基因敲除C57/BL小鼠16只(模型組8只、觀察組8只)，其中實(shí)驗(yàn)組及模型組予高脂飼料喂養(yǎng)，對照組及觀察組予普通飼料喂養(yǎng)，共8周。

1.3 觀察項(xiàng)目 檢測各組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平；肝臟組織HE染色觀察肝細(xì)胞形態(tài)；提取肝臟細(xì)胞總RNA、蛋白等。

1.4 肝臟HE染色 取肝臟組織按照實(shí)驗(yàn)要求處理后經(jīng)過固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘干、脫蠟、HE染色、封片后，光鏡下閱片。

1.5 PPAR-α mRNA表達(dá)檢測 取10 mg肝臟組織，按照TaKaRa說明書進(jìn)行mRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄等步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，然后取2 μl cDNA為模版，根據(jù)SYBR法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參考相關(guān)文獻(xiàn)[16]，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)44次，采用2-△△CT法分析目的基因的相對表達(dá)量。相關(guān)引物序列如表1所示。

表1 小鼠PPAR-α目的基因RT-PCR引物序列及擴(kuò)增長度Tab 1 PPAR-α RT-PCR primer sequence in mice

1.6 PPAR-α蛋白表達(dá)量檢測 按照碧云天公司蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行核蛋白提取，根據(jù)說明書配制分離膠和濃縮膠，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育等操作后在暗房進(jìn)行顯影曝光，并對各組樣本蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較用One way-ANOVA分析，組間比較使用Student-Newman-Keulsq檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及血清生化指標(biāo)比較 模型組較觀察組小鼠體質(zhì)量明顯增加，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，體質(zhì)量明顯減少(P<0.05)，而模型組與實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。血清生化指標(biāo)方面，模型組與實(shí)驗(yàn)組相比較，血清ALT、TG、TC等指標(biāo)及肝臟指數(shù)均明顯升高(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組與對照相比較，血清ALT、TC等指標(biāo)及肝臟指數(shù)也明顯升高(P<0.05，見表2)。

2.2 肝臟HE染色結(jié)果 對照組小鼠肝臟細(xì)胞邊緣規(guī)則，界限清晰，光鏡下肝細(xì)胞漿內(nèi)未見脂肪滴，核仁無偏移(見圖1A、2A)；實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟增大，邊緣稍鈍，細(xì)胞漿內(nèi)有較多脂滴，提示小鼠脂肪肝模型成功建立(見圖1B、2B)；模型組小鼠肝臟肉眼可見邊緣圓鈍，呈金黃色改變，鏡下見大量脂肪滴聚集，伴有肝細(xì)胞腫脹、增大，部分可見淋巴細(xì)胞聚集，提示肝臟存在炎癥改變(見圖1C、2C)；觀察組小鼠肝臟體積較模型組減小，呈深紅色，邊緣稍銳利，鏡下見少量脂肪滴，肝細(xì)胞排列較整齊，無炎癥細(xì)胞聚集(見圖1D、2D)。

表2 各組小鼠體質(zhì)量及血清生化指標(biāo)比較 ±s)Tab 2 The comparison of weigh and serum indexes in different groups of mice ±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，**P<0.05。

圖1 各組小鼠肝臟肉眼外觀圖 A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組；C：模型組；D：觀察組Fig 1 Liver histology in different groups of mice A: control group; B: experiment group; C: model group; D: observation group

圖2 各組小鼠肝臟HE染色病理切片(40×) A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組；C：模型組；D：觀察組Fig 2 HE staining of mice livers biopsy (40×) A: control group; B: experiment group; C: model group; D: observation group

2.3 各組小鼠PPAR-α mRNA相對表達(dá)水平 與對照組(1.521±1.162)相比，實(shí)驗(yàn)組PPAR-α mRNA表達(dá)降低(0.819±0.485)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與實(shí)驗(yàn)組相比，模型組PPAR-α mRNA表達(dá)水平(2.687±1.907)明顯升高(P<0.05)，觀察組肝臟組織表達(dá)水平(1.827±1.446)也較對照組表達(dá)水平升高，提示在FXR基因敲除小鼠中PPAR-α表達(dá)升高。

2.4 各組小鼠PPAR-α蛋白表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組小鼠PPAR-α蛋白表達(dá)(0.505±0.276)較對照組(0.566±0.153)減少(P<0.05)。與實(shí)驗(yàn)組相比，模型組PPAR-α蛋白表達(dá)水平(0.696±0.027)明顯升高(P<0.05)，而觀察組蛋白水平(0.646±0.008)則較模型組下降，但仍高于對照組(P<0.05，見圖3、圖4)。

注：A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組；C：模型組；D：觀察組。圖3 內(nèi)參蛋白；圖4 PPAR-α蛋白Fig 3 GAPDH; Fig 4 PPAR-α

2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性 圖5、圖6是PPAR-α、β-actin擴(kuò)增曲線圖，呈S型曲線；圖7、圖8可見PPAR-α、β-actin融解曲線呈單一峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。

圖5 小鼠PPAR-α擴(kuò)增曲線；圖6 小鼠β-actin擴(kuò)增曲線Fig 5 Amplification curve of PPAR-α; Fig 6 Amplification curve of β-actin

圖7 小鼠PPAR-α融解曲線Fig 7 Melting curve of PPRA-α

圖8 小鼠β-actin融解曲線Fig 8 Melting curve of β-actin

3 討論

NAFLD作為慢性肝病的一種，除了有由于肝細(xì)胞變性引起肝功能受損的表現(xiàn)以外，通常還可伴隨有高脂血癥、高血壓、體質(zhì)量超重、血糖異常等代謝綜合征的表現(xiàn)。既往不少NAFLD動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)使用高脂飼料造成的NAFLD動(dòng)物模型其體質(zhì)量都會(huì)較正常飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物顯著增加，然而在我們的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，我們卻發(fā)現(xiàn)高脂飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物體質(zhì)量均較正常飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物體質(zhì)量有所減輕，但是肝臟指數(shù)卻明顯增加，病理切片顯示肝細(xì)胞脂肪沉積，血清ALT、TG、TC均升高，提示NAFLD動(dòng)物模型成功建立。本研究中選用的高脂飼料中含有丙硫氧嘧啶，雖然能抑制體內(nèi)脂肪分解，促進(jìn)內(nèi)臟脂質(zhì)沉積，但由于其口感偏苦，使小鼠進(jìn)食量減少，食物熱量攝入減少而出現(xiàn)體質(zhì)量較普通飼料喂養(yǎng)的小鼠減輕。

本研究采用RT-PCR和Western blotting檢測各組小鼠肝臟中PPAR-α mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟PPAR-α mRNA及蛋白均明顯減少，但是在FXR基因敲除小鼠中卻發(fā)現(xiàn)其肝臟PPAR-α mRNA和蛋白的表達(dá)均較對照組及實(shí)驗(yàn)組明顯升高，提示FXR基因功能缺陷可能對PPAR-α的表達(dá)產(chǎn)生雙向影響，使PPAR-α在NAFLD中的表達(dá)升高，但血清ALT、TC卻比正常NAFLD小鼠明顯升高，且基因敲除小鼠的肝臟脂肪變性及炎癥反應(yīng)均較野生型小鼠嚴(yán)重，我們猜測可能是因?yàn)镻PAR-α在調(diào)控脂質(zhì)代謝的通路中受到FXR功能缺陷的影響，影響其下游表達(dá)，使其出現(xiàn)一個(gè)類似負(fù)反饋表現(xiàn)的表達(dá)升高，但不能對肝臟脂肪變性起到保護(hù)作用，反而促進(jìn)了NAFLD的疾病進(jìn)展。也有可能是FXR通過其他方面如表觀遺傳學(xué)方面影響PPAR-α基因的功能，上調(diào)PPAR-α表達(dá)等[17]。至于是哪個(gè)環(huán)節(jié)受到影響則需要行下一步的基因功能驗(yàn)證來確定。

綜上所述，由于FXR基因功能缺陷對PPAR-α的表達(dá)具有雙向影響，F(xiàn)XR的表達(dá)與PPAR-α的表達(dá)可能具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，因此，通過改善FXR功能以后再給予PPAR-α相關(guān)激動(dòng)劑對于NAFLD的治療可能會(huì)有更佳的效果。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Experimental study of gene FXR for PPAR-α effects in the pathogenesis of NAFLD

QIU Ruirui,ZHOU Yongjian,NIE Yuqiang,DU Yanlei,LI Yuyuan

Guangzhou First People’s Hospital,Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180,China

Objective To investigate whether FXR is correlated with the change of PPAR-α expression in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).Methods Normal mice and FXR deficiency mice were divided into four groups (control group,experiment group,model group,observation group),which were fed with chow diet or high-fat diet for 8 weeks. Then biochemical assays were used to access the serum ALT,TG,TC. Livers FXR expression and PPAR-α expression were also detected.Results Serum biochemical assays were higher in model group,as well as PPAR-α mRNA and protein expression in livers compared with experiment group (P<0.05). Moreover,HE staining showed lots of fatty droplets and lymphocyte in livers in model group,which indicated liver dysfunction and NASH-like changes.Conclusion During NAFLD development,FXR maybe have a negative correlation with PPAR-α which regulates downstream genes.

Non-alcoholic fatty liver disease; Farnesoid X receptor; Peroxisome proliferator activated receptor-α

廣州市衛(wèi)生局重大疾病綜合防治(2014Y2-000139)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2009-ZDi-03)

邱睿睿，碩士，研究方向：非酒精性脂肪性肝病。E-mail:815531221@qq.com

周永健，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：非酒精性脂肪肝。E-mail: zhouyongjian1968@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.02.011

R575

A

1006-5709(2016)02-0159-05

2015-04-16