仲芹芹，呂小婷，劉軍權(quán)，陳復(fù)興，費素娟

1.徐州醫(yī)學院，江蘇 徐州221000；2.徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化科；3.中國人民解放軍第九七醫(yī)院

胃癌患者外周血Vδ2+γδT細胞及其細胞因子的水平變化

仲芹芹1，呂小婷3，劉軍權(quán)3，陳復(fù)興3，費素娟2

1.徐州醫(yī)學院，江蘇 徐州221000；2.徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化科；3.中國人民解放軍第九七醫(yī)院

目的 研究胃癌患者外周血Vδ2+γδT細胞及其細胞因子的變化情況，并探討其臨床意義。方法 分離胃癌患者及正常人外周血單個核細胞(PBMC)，采用多種熒光標記抗體標記細胞表面分子，流式細胞術(shù)分析Vδ2+γδT型細胞及其干擾素γ(IFN-γ)、白介素17A(IL-17A)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達情況。結(jié)果 胃癌患者外周血的Vδ2+γδT細胞比例與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Vδ2+γδT細胞中分泌IL-17A的細胞比例為(5.26±2.50)%，明顯高于對照組(3.48±1.76)%(P<0.05)。胃癌組外周血IFN-γ+Vδ2+γδT細胞與TNF-α+Vδ2+γδT細胞比例分別為(46.24±20.01)%、(43.78±19.85)%，與對照組(60.10±20.75)%、(54.67±19.02)%比較顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 胃癌患者外周血中分泌IFN-γ和TNF-α的Vδ2+γδT細胞比例顯著減少，而分泌IL-17A的Vδ2+γδT細胞顯著增加。提示上述三種細胞因子的分泌異?？赡芘c胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

胃癌；Vδ2+γδT細胞；IFN-γ；白介素-17A；腫瘤壞死因子α

胃癌是我國常見的消化道腫瘤，其年發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤的第3位[1]，是危害我國人民健康的重大疾病之一，降低胃癌的發(fā)病率和死亡率是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。胃癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，對胃癌病因?qū)W和危險因素的研究可為胃癌的一二級預(yù)防提供重要依據(jù)。機體免疫功能異常是腫瘤發(fā)生因素之一，其中細胞免疫功能的降低與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。根據(jù)T細胞抗原受體(T cell antigen receptor，TCR)類型的不同，可將T細胞分為αβT細胞和γδT細胞。γδT細胞作為機體固有免疫的一個重要細胞群，可通過釋放顆粒酶、穿孔素、細胞因子，或NKG2D、FasL等途徑識別并殺傷多種腫瘤細胞。且γδT細胞對腫瘤細胞具有主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)非限制性細胞毒性作用[2]。人類γδT細胞主有Vδ1+T細胞和Vδ2+T細胞兩大亞群，其中Vδ2+γδT細胞亞群主要存在于外周血中[3]。目前有關(guān)胃癌患者外周血中Vδ2+γδT細胞及其細胞因子水平的研究報道較少，本研究旨在比較胃癌患者與正常人外周血中Vδ2+γδT細胞及其相關(guān)細胞因子的變化情況，以期為胃癌患者的細胞免疫治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月-2013年12月在徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化科住院的胃癌患者為胃癌組，共30例，所有患者均經(jīng)胃鏡、病理及腹部CT診斷為胃癌，均無HIV、病毒性肝炎感染，無重大內(nèi)科疾病、無自身免疫性疾病，且無免疫抑制劑使用等病史。標本采集前均未經(jīng)過手術(shù)、放療、化療及其他抗腫瘤治療。30例胃癌患者中，男18例，女12例，年齡31～75歲，中位年齡61.5歲。按照國際抗癌聯(lián)盟臨床TNM分期標準，TNMⅠ/Ⅱ期組14例，Ⅲ/Ⅳ期組16例；中分化癌11例，低分化癌18例，有1例分化級別不確定(開腹時見腹腔廣泛轉(zhuǎn)移未取大體病理化驗)；腺癌29例，有1例病理類型不確定(影像學檢查示遠處轉(zhuǎn)移未行手術(shù))；對照組21名，為同期徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院健康體檢者，男14名，女7名，年齡27～68歲，中位年齡52.0歲。

1.2 主要試劑和儀器 熒光標記抗體(抗人Vδ2 TCR、IFN-γ、TNF-α、IL-17A)及淋巴細胞刺激劑(LEUKO ACTVTN GolgiPlug)購自BD Biosciences公司；膜固定劑及破膜劑購自ADG公司；RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清購自Gibco公司；FACS Calibur流式細胞儀購自BD Biosciences公司。

1.3 方法 抽取人空腹外周靜脈血4 ml，采用密度梯度離心法獲得PBMC，加入含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中配成單細胞懸液，細胞濃度為1×106個/ml。加入淋巴細胞刺激劑，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，以375×g離心5 min，棄上清液。加入2 μl FITC標記鼠抗人Vδ2 TCR單抗，室溫避光孵育15 min。加入膜固定劑100 μl，室溫避光孵育15 min。PBS洗滌后，以375×g離心5 min，棄上清液。加入破膜劑100 μl，分別加入PE標記鼠抗人IFN-γ單抗20 μl、PE標記鼠抗人IL-17A單抗20 μl和PE 標記鼠抗人TNF-α單抗20 μl，室溫避光孵育15 min。PBS洗滌，以375×g離心5 min，棄上清液，PBS重懸細胞上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 外周血Vδ2+γδT細胞及其IFN-γ、IL-17A、TNF-α的表達水平 胃癌組和對照組Vδ2+γδT細胞占外周血淋巴細胞的比例分別為(2.37±1.08)%、(2.72±1.37)%，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。雖然胃癌的發(fā)生率男性是女性的2倍[1]，但是Vδ2+γδT細胞的比例與性別無相關(guān)性(見圖1～2、表1)。

胃癌組外周血Vδ2+γδT細胞中，分泌IFN-γ和TNF-α的細胞比例分別為(46.24±20.01)%、(43.78±19.85)%，顯著低于對照組(60.10±20.75)%、(54.67±19.02)%(P<0.05)。IL-17A+Vδ2+γδT細胞比例為(5.26±2.50)%，顯著高于對照組(3.48±1.76)%(P<0.05)。三種細胞因子的表達在不同性別中比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表1)。

2.2 胃癌患者γδT細胞及其細胞因子與胃癌分化程度、臨床分期之間的關(guān)系 胃癌患者外周血Vδ2+γδT細胞及其IFN-γ、IL-17A、TNF-α的表達在不同分化程度、不同臨床分期中，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖3)。

圖1 外周血Vδ2+γδT細胞及細胞因子的FCM檢測(以IL-17A為例)Fig 1 Detection of peripheral blood Vδ2+γδT cells and cytokines by FCM (IL-17A as an example)

圖2 Vδ2+γδT細胞IFN-γ、IL-17A、TNF-α的表達(FCM檢測) A：胃癌組；B：對照組Fig 2 Expressions of IFN-γ,IL-17A and TNF-α in Vδ2+γδT cells (detected by FCM) A: GC group; B: control group

表1 外周血Vδ2+γδT細胞及其IFN-γ、IL-17A和TNF-α的表達

注：與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

注：MGD：中分化；LGD：低分化；NS：差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 胃癌患者外周血Vδ2+γδT細胞及其細胞因子與胃癌分化程度、臨床分期之間的關(guān)系 A：胃癌Ⅰ/Ⅱ期vsⅢ/Ⅳ期；B：中分化癌vs低分化癌
Fig 3 Relationship of peripheral blood Vδ2+T cells,cytokines with the differentiation degree and clinical stages in patients with gastric cancer A: Ⅰ/ⅡphasevsⅢ/Ⅳ phase; B: MGDvsLGD

2.3 三種細胞因子之間的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IFN-γ與TNF-α在胃癌組及對照組均呈顯著相關(guān)，胃癌組相關(guān)系數(shù)r=0.76(P=0.00)；對照組相關(guān)系數(shù)r=0.59(P=0.01)，而兩組中IFN-γ、TNF-α的表達水平與IL-17A的表達水平之間均無相關(guān)性(見圖4)。

圖4 三種細胞因子之間的相關(guān)性分析 A：IFN-γ vs IL-17A；B：TNF-α vs IL-17A；C：IFN-γ vs TNF-αFig 4 Correlation analysis among IFN-γ,TNF-α and IL-17A A: IFN-γ vs IL-17A; B: TNF-α vs IL-17A; C: IFN-γ vs TNF-α

3 討論

γδT細胞具有天然免疫的特點，在外周血T細胞中比例僅為1%～5%，但當疾病發(fā)生時，能迅速為機體提供第一道防線[3]。γδT細胞能夠直接殺傷或通過多種途徑激發(fā)機體對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答，而不影響正常細胞，γδT細胞也可浸潤腫瘤組織，通過多種方式抑制腫瘤細胞增長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[2]。同時，γδT細胞具有非MHC限制性抗腫瘤作用，而腫瘤細胞通常缺乏MHCⅠ類分子的表達，故γδT細胞在腫瘤免疫治療中為一種具有優(yōu)勢的候選細胞。在臨床中，γδT細胞的過繼免疫治療已被應(yīng)用于晚期腎癌[4]、復(fù)發(fā)性非小細胞肺癌[5]等多種腫瘤患者的治療。

近年來，國外有學者相繼報道了胃癌患者外周血γδT細胞的變化及其在免疫治療中的應(yīng)用。Lee等[6]報道，早期胃癌患者外周血中γδT細胞比例顯著增加，晚期胃癌患者外周血中γδT細胞則明顯降低，推測γδT細胞在早期胃癌患者外周血中升高可能具有抗腫瘤作用，而在晚期胃癌中下降可能與腫瘤進展、免疫系統(tǒng)被抑制有關(guān)，同時也提示胃癌患者外周血中γδT細胞數(shù)量的增加可能是患者預(yù)后較好的一個指標[7]。Wada等[8]利用唑來膦酸和IL-2體外培養(yǎng)Vδ2+γδT細胞治療晚期胃癌伴惡性腹水的患者，發(fā)現(xiàn)治療后胃癌患者腹水中腫瘤細胞數(shù)較治療前顯著減少，且7例患者中有2例腹水得到控制，提示Vδ2+γδT細胞具有抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，胃癌患者外周血中Vδ2+γδT細胞的比例，與正常人無明顯差異，且與胃癌的疾病進程無關(guān)，與Kuroda等[9]的研究結(jié)果一致，但與Lee等[6]的結(jié)果不同，可能與患者的地區(qū)差異和檢測的γδT細胞的分型不同有關(guān)。

IFN-γ是一種具有抗腫瘤活性的細胞因子，能夠提高活化巨噬細胞、CTL、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、NK細胞等對腫瘤細胞的殺傷能力；能夠下調(diào)周期蛋白和周期依賴性蛋白激酶的表達，影響腫瘤細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖；還可通過抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子的生成，抑制腫瘤血管的生成，從而抑制腫瘤細胞增殖。臨床上已有IFN-γ聯(lián)合化療藥物治療晚期肝癌，并取得了一些療效[10]。TNF-α主要由單核巨噬細胞分泌，可直接殺傷腫瘤細胞。有研究證實，γδT細胞可產(chǎn)生多種細胞因子如IFN-γ、TNF-α[4]，發(fā)揮特異性抗腫瘤作用[11]。而γδT細胞功能異常，則可導(dǎo)致機體處于免疫抑制狀態(tài)，引起腫瘤細胞免疫逃逸，加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血Vδ2+γδT細胞中IFN-γ和TNF-α的表達較對照組明顯下降，推測胃癌的發(fā)生可能與IFN-γ和TNF-α減少導(dǎo)致γδT細胞抗腫瘤效應(yīng)下降有關(guān)。另外，IFN-γ和TNF-α的表達呈正相關(guān)，提示IFN-γ與TNF-α可能存在協(xié)同性抗腫瘤作用。

IL-17是一種重要的炎性介質(zhì)，可誘導(dǎo)前炎癥因子IL-6、IL-1β、急性反應(yīng)蛋白、趨化因子MCP-1、MIP-2和粒-巨細胞刺激因子(GM-CSF)等表達，促進中性粒細胞的活化和增殖，在病原體感染早期時發(fā)揮保護作用[12]。IL-17還可上調(diào)組織細胞表面細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)的表達，介導(dǎo)T細胞和炎癥細胞在組織中的浸潤，并與IFN-γ、TNF-α、IL-1β等細胞因子發(fā)揮協(xié)同性作用，放大靶器官的炎癥性破壞及免疫反應(yīng)，加重一些自身免疫性疾病的進展[13]。關(guān)于IL-17在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用目前尚存在爭議[14-15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)，高表達IL-17的胃癌患者的5年生存率顯著高于IL-17低表達的患者，認為IL-17在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了抗腫瘤作用。Wakita等[14]報道，纖維肉瘤細胞系CMS-G4在IL-17(-/-)小鼠體內(nèi)生長的速度較野生小鼠明顯下降，且腫瘤病灶區(qū)域血管密度顯著降低，推測IL-17可能通過激發(fā)腫瘤血管生成參與腫瘤的形成過程。以往的研究認為IL-17主要由Th17細胞分泌，近來發(fā)現(xiàn)γδT細胞也可產(chǎn)生IL-17[13]。Chen等[17]報道，食管癌患者外周血中的IL-17+Th17細胞顯著增加，且食管癌晚期較食管癌早期升高更明顯，提示IL-17+Th17細胞的增加可作為食管癌預(yù)后較差的指標之一。IL-17家族由5個受體(IL-17RA-E)和6個配體(IL-17A-F)組成，其中IL-17A是家族的主要成員，現(xiàn)已證實IL-17A、IL-17E和IL-17F為重要的促炎因子，但是IL-17B、IL-17C和IL-17D的功能尚不明確[18]。人體幾乎所有類型的細胞都可表達IL-17受體，但是不同組織細胞所表達的受體類型不同，T淋巴細胞僅表達IL-17RA[19]，即T淋巴細胞只可能與IL-17A結(jié)合。Wu等[20]的研究結(jié)果顯示胃癌組織中IL-17A的表達上調(diào)，且主要表達于血管內(nèi)皮細胞和淋巴細胞，提示了IL-17A可能通過誘導(dǎo)血管生成促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中IL-17A+γδT細胞的表達較正常人明顯升高，與上述文獻結(jié)果相一致。

本研究顯示與正常人相比，胃癌患者外周血Vδ2+γδT細胞分泌的IFN-γ和TNF-α顯著減少，而IL-17A升高，提示胃癌患者體內(nèi)Vδ2+γδT細胞的免疫功能異常可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進一步研究如何增加Vδ2+γδT細胞中IFN-γ和TNF-α的表達，降低IL-17A的分泌，可為胃癌的防治提供新的策略。

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(責任編輯：馬 軍)

Changes of Vδ2+γδT cells and cytokines in peripheral blood of patients with gastric cancer

ZHONG Qinqin1,LV Xiaoting3,LIU Junquan3,CHEN Fuxing3,FEI Sujuan2

1.Xuzhou Medical College,Xuzhou 221000; 2.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College; 3.Department of Central Laboratory,97th Hospital of PLA,China

Objective To investigate the changes of γδT cells and cytokines in peripheral blood in patients with gastric cancer (GC) and to explore the clinical significance.Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from patients with gastric cancer and normal donors. The cell surface molecules were labeled with multiple fluorescent labeling antibodies. Flow cytometry (FCM) was used to detect Vδ2+γδT cells and the expressions of IFN-γ,IL-17A and TNF-α.Results There was no difference in total percentages of peripheral blood Vδ2+γδT cells between GC patients and normal donors. The proportion of Vδ2+γδT cells producing IL-17A in GC patients was (5.26±2.50)%,significantly higher than that (3.48±1.76)% in healthy controls (P<0.05). While the proportions of IFN-γ- and TNF-α-positive Vδ2+γδT cells were significantly lower than those in healthy controls [(46.24±20.01)%vs(60.10±20.75)% and (43.78±19.85)%vs(54.67±19.02)% (P<0.05)].Conclusion For GC patients,Vδ2+γδT cells in peripheral blood show significantly increased secretion of IL-17A whereas a significant reduction of IFN-γ and TNF-α. Above all,the three kinds of cytokines secretion abnormalities may be related to the occurrence and development of gastric cancer.

Gastric cancer; Vδ2+γδT cells; IFN-γ; Interleukin-17A; Tumor necrosis factor-α

江蘇省“六大人才高峰”項目(WS-067)

仲芹芹，碩士在讀。E-mail：zhongqq1990@163.com

費素娟，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化道腫瘤的臨床與基礎(chǔ)研究。E-mail：xyfyfeisj99@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.02.020

R735.2

A

1006-5709(2016)02-0188-05

2015-04-09