李　慧

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院皮膚科，湖北　恩施　445000)

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白藜蘆醇下調(diào)Cyclin家族表達(dá)調(diào)節(jié)皮膚癌HS-4細(xì)胞的增殖

李慧

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院皮膚科，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探討中藥白藜蘆醇(Res)對(duì)人皮膚癌HS-4細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用。方法利用MTT實(shí)驗(yàn)篩選Res對(duì)人皮膚癌HS-4細(xì)胞的最適作用濃度，對(duì)細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行測(cè)定；利用流式細(xì)胞技術(shù)觀察Res對(duì)人皮膚癌HS-4細(xì)胞增殖周期產(chǎn)生的影響；采用Real-time PCR檢測(cè)某些周期相關(guān)因子的mRNA表達(dá)；Western印跡檢測(cè)某些周期相關(guān)蛋白改變情況。結(jié)果Res對(duì)人皮膚癌HS-4細(xì)胞毒性存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，其中20 mg/L的Res作用72 h對(duì)人皮膚癌HS-4細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到最大；加入Res處理48 h 后人皮膚癌HS-4的G0/G1期細(xì)胞數(shù)目明顯比對(duì)照組多(P<0.05)，S 期細(xì)胞數(shù)目比對(duì)照組低(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞數(shù)目?jī)山M差別不明顯；Real-time PCR和Western印跡檢測(cè)某些周期相關(guān)因子均發(fā)生明顯改變。結(jié)論Res可抑制HS-4細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能是其能影響皮膚癌HS-4細(xì)胞周期，將其阻滯于G1期，為Res在皮膚癌中應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕白藜蘆醇；皮膚癌；細(xì)胞周期

皮膚癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌〔1〕，近年來(lái)發(fā)病率越來(lái)越高〔2,3〕。白藜蘆醇(Res)是一種植物抗毒素，廣泛存在于多種植物中。許多研究發(fā)現(xiàn)Res有多種生物活性，如抗氧化、改善微循環(huán)以及抗感染等〔4〕。Res對(duì)多種腫瘤都有一定的治療作用，例如乳腺癌、肝癌、胃癌及肺癌等〔5～8〕。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究Res對(duì)皮膚癌HS-4細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用，明確其對(duì)皮膚癌是否也具有抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1藥物和制劑Res(美國(guó)Sigma公司,純度>99%)，用二甲基亞砜(DMSO)溶解,0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾除菌,母液質(zhì)量濃度為100 g/L,-20℃避光保存。HS-4細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC，胎牛血清、Trypin-EDTA 及DMEM培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司，MTT、DMSO 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(中國(guó)上海貝博生物有限公司)，一抗及二抗購(gòu)自武漢三鷹公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿、TEMED、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨(APS)、吐溫-20(Tween-20)購(gòu)于上海生工生物工程公司。電化學(xué)(ECL)顯影液west Femto 及ECL west Pico 顯影液購(gòu)于美國(guó)Pierce 公司，TRIzol 試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Fermentas 公司，Real-time PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara 公司。

1.2儀器化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)GE Healthcare，型號(hào)LAS4000)，超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司，型號(hào)ZHJH-C1109B )，移液器(美國(guó)Eppendorf 公司)，垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)165-3301 )，熒光定量PCR 儀(美國(guó)Stratagene 公司，型號(hào)Mx3000P)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)Forma 3111)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)HS-4細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于 5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。用含0.02% EDTA的0.25% 胰酶消化液消化細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，傳至4、5代左右，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、增殖旺盛的細(xì)胞用于研究。

1.3.2MTT法檢測(cè)人皮膚癌HS-4細(xì)胞的增殖取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化，輕柔吹勻，調(diào)整為密度為3×104～3.5×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μl，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)6 h后，實(shí)驗(yàn)組加入含有Res成分的培養(yǎng)基，并在0 h的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每孔中加入20 μl的MTT。反應(yīng)4 h后，棄液，加入150 μl DMSO，置于搖床上勻速搖30 min，待結(jié)晶完全溶解后，用空白調(diào)零，利用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm下各孔的光吸收值，實(shí)驗(yàn)組的抑制率= 1 - A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組× 100%。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HS-4細(xì)胞，接種于6 孔板內(nèi)，每孔2×104個(gè)/ml，加入2 ml培養(yǎng)基。置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，換成無(wú)血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞周期同步化。當(dāng)細(xì)胞達(dá)50%融合時(shí)，加入2.00 mg/L的 Res，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)的細(xì)胞2 000 r/min離心15 min，重懸于200 μl 4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，緩慢輕柔的加入600 μl 75%的預(yù)冷的乙醇，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行懸浮固定，4℃過(guò)夜。離心棄乙醇，500 μl PBS重懸細(xì)胞，加入RNaseA至終濃度100 μg/ml，37℃水浴30 min，碘化丙啶(PI，20 μg /ml)染色30 min，上機(jī)檢測(cè)，利用Mod Fit LT軟件分析細(xì)胞周期。

1.3.4Real-time PCR檢測(cè)某些周期相關(guān)因子的表達(dá)檢測(cè)加入Res后HS-4細(xì)胞中P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。抽提RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件:42℃ 60 min，70℃ 10 min。以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA 為模板，使用Real-time PCR檢測(cè)P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。內(nèi)參照為GAPDH。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件:95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件:95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的Ct 值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù))，通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算樣品中多種mRNA 的相對(duì)表達(dá)量〔3〕，所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.5Western印跡分析將對(duì)照組和Res組培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞按2×104個(gè)/孔的數(shù)量加入6孔板中，培養(yǎng)72 h后，用PBS洗滌3次，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，12 000 r /min離心30 min，收集上清。抽提總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，然后加入5×loading，95℃浴煮10 min。40 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，用濕式轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉60 min，將PVDF膜用TBST洗滌2次，10 min/次。分別加入相應(yīng)抗體，內(nèi)參用鼠抗人GAPDH，4℃孵育過(guò)夜后棄去一抗，用TBST洗滌3次×15 min。再分別加入辣根酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后棄抗體，然后用TBST 洗滌3次，每次15 min?；瘜W(xué)發(fā)光儀使用ECL 顯影液進(jìn)行顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Res對(duì)HS-4細(xì)胞增殖的抑制作用Res可明顯抑制HS-4細(xì)胞的增殖，藥物濃度為20 mg/L、時(shí)間為72 h對(duì)細(xì)胞增殖影響變化最明顯 (見(jiàn)圖1)。

圖1　Res對(duì)HS-4細(xì)胞增殖的影響

2.2Res對(duì)細(xì)胞周期的影響20 mg/L的Res作用48 h后可對(duì)人皮膚癌HS-4細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生明顯的阻滯作用，影響了HS-4細(xì)胞周期各時(shí)相的分布，G0/G1期細(xì)胞比例(89.0%±4.41%)顯著高于助溶劑DMSO對(duì)照組(80.8%±2.84%)(P<0.01)，S 期細(xì)胞比例(6.14%±0.63%)顯著低于對(duì)照組(13.34%±1.22%)(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞比例(4.86%±1.69%，5.87%±2.41%)無(wú)顯著性差異。

2.3Western印跡檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)采用兔抗P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D單克隆抗體，選取GAPDH為內(nèi)參，運(yùn)用Western印跡檢測(cè)20.00 mg/L Res處理細(xì)胞72 h后抽提的蛋白與對(duì)照組中相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況，P21 表達(dá)上調(diào)，PCNA 表達(dá)下調(diào)，Cyclin 家族Cyclin A、Cyclin B及Cyclin D均表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖2。

圖2　Western印跡檢測(cè)周期相關(guān)因子

2.4Real-time PCR檢測(cè)某些周期相關(guān)因子的表達(dá)20 mg/L的Res作用48 h后，周期相關(guān)因子P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均發(fā)生明顯改變(分別為2.8、0.51、0.24、0.37、0.32，對(duì)照組設(shè)為1)，細(xì)胞周期阻滯在G1期。

3討論

Res化學(xué)名稱為 3，4'，5-三羥基芪，1940年第一次從毛葉葉黎蘆(veratrum grandiortua O.Loes)的根部分離獲得〔9〕。眾所周知，生長(zhǎng)信號(hào)的異?；罨瘜⑦M(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常的發(fā)生〔10〕。隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤共性在于其無(wú)限性生長(zhǎng)，而眾學(xué)者認(rèn)為這種無(wú)限增殖行為的產(chǎn)生可能是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致〔11〕。因此，我們可以認(rèn)為腫瘤是一種細(xì)胞無(wú)限性生長(zhǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞疾病〔12〕。大量研究顯示，Res 可以預(yù)防和緩解癌癥、心血管疾病等多種疾病〔13〕。Res 對(duì)多種癌癥都有不同程度的拮抗作用，如胃腸道癌、生殖器官癌、結(jié)直腸癌等〔14～16〕。因此，Res被認(rèn)為是目前最有望進(jìn)入臨床的天然抗癌藥之一。

本研究結(jié)果推測(cè)20.00 mg/L的Res可能是其最大值，濃度越高，彼此之間有重疊，反而削弱了其增殖抑制作用。流式結(jié)果顯示，經(jīng)Res處理后細(xì)胞周期阻滯在G1期，細(xì)胞增殖速度慢，DNA合成量減少，從而大大降低腫瘤細(xì)胞數(shù)目。Real-time PCR 和Western印跡對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)因子的檢測(cè)結(jié)果也表明Res處理后細(xì)胞阻滯在G1期，P21表達(dá)水平上調(diào)明顯，PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D表達(dá)水平均下調(diào)明顯，出現(xiàn)明顯的抑制增殖趨勢(shì)。

綜上所述，20.00 mg/L Res處理人皮膚癌HS-4細(xì)胞能夠顯著抑制HS-4細(xì)胞的惡性增殖，減少腫瘤數(shù)目，從而為皮膚癌的診治提供新的思路，有望成為皮膚癌治療的新方法，值得在臨床推廣。

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〔2015-07-26修回〕

(編輯李相軍)

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)08-1802-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.005

第一作者：李慧(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事皮膚性病研究。