馬　俊　顧　勇　魯建軍　繆　蓉　羅紅鶴

(中山大學附屬第一醫(yī)院胸外科，廣東　廣州　510080)

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奈達鉑耐藥食管鱗癌患者血清雙向電泳聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的蛋白篩選

馬俊顧勇魯建軍繆蓉1羅紅鶴

(中山大學附屬第一醫(yī)院胸外科，廣東廣州510080)

〔摘要〕目的探討奈達鉑耐藥食管鱗癌患者及奈達鉑敏感患者的血清蛋白表達譜的差異性及食管鱗癌奈達鉑耐藥的相關(guān)血清蛋白。方法采用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離奈達鉑敏感及奈達鉑耐藥患者的血清蛋白樣本共40例，建立雙向凝膠電泳(2-DE)圖譜，再應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)及數(shù)據(jù)庫鑒定部分差異蛋白質(zhì)。結(jié)果采用2-DE技術(shù)成功獲得分辨率高和重復性好的蛋白表達圖譜，凝膠圖像軟件分析后獲得差異≥1.5倍以上的蛋白質(zhì)共68個，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出8種蛋白，其中表達增高的有谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)P1、乳酸脫氫酶(LDH)-B、Sox-2、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-1和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7，表達降低的有E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、激活素結(jié)合蛋白(FS)和磷酸甘油酸激酶(PGK)1。結(jié)論應用2-DE技術(shù)分離奈達鉑耐藥食管鱗癌患者及奈達鉑敏感患者的血清蛋白表達譜，并通過MALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定出與食管鱗癌奈達鉑耐藥相關(guān)的蛋白，為食管鱗癌耐藥相關(guān)標志物的篩選提供了新的技術(shù)方法及候選分子。

〔關(guān)鍵詞〕雙向凝膠電泳；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜；食管鱗癌；耐藥；奈達鉑

奈達鉑是臨床常用的一種化療藥物，也是治療食管鱗癌的一線用藥，并且具有良好的臨床應用效果。然而，食管鱗癌奈達鉑耐藥是一種普遍發(fā)生的獲得性耐藥，這一問題嚴重限制了奈達鉑的抗癌療效〔1〕。本研究擬通過收集奈達鉑耐藥食管鱗癌患者及奈達鉑敏感患者的血清蛋白，采用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)分離、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)及生物信息學進行分析鑒定，旨在尋找食管鱗癌奈達鉑耐藥相關(guān)蛋白標志物。

1材料和方法

1.1臨床樣本按照實體瘤的療效評價標準(RECIST )〔2〕，共采集食管鱗癌患者血清樣本40例，分別為20例接受奈達鉑為基礎(chǔ)的化療后疾病進展(PD)及20例部分緩解(PR)的食管鱗癌患者，并以治療后PR的20例患者作為對照，每組的3個樣本混合提取蛋白，且每組樣本各重復檢測3次。兩組患者的年齡、性別、腫瘤部位、病理類型、分化程度、臨床分期和功能狀況評分量表(KPS)評分等均無明顯差異，具有可比性。

1.2試劑及儀器設備血清去除高分度蛋白：血清去高分度蛋白試劑盒ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit (Sigma，美國)。一向等點聚焦：超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，LTD JY96-Ⅱn)；分光光度計(上海光譜儀器有限公司Spectrum SHANHAI 765Pc)；冷凍離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司，LTD Hema TGL-18R)；水化盤immobile drystrip rewelling tray(GE，美國)；等電聚焦儀(GE ETTAN IPGPHOR3)。二向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：電泳槽(GE ETTAN DALTsix)。染色：掃描儀(UMAX Powerlook 1100)。圖像分析：ImageMaster 2D platinum 5.0(GE，美國)。質(zhì)譜前處理：真空干燥機(上海一恒科學儀器有限公司DZF-6020)；鋼靶(ABI，美國)；羥基肉桂酸(HCCA，基質(zhì)，ABI，美國)。質(zhì)譜檢測：Ultraflex Ⅲ TOF/TOF質(zhì)譜儀(德國)。數(shù)據(jù)庫檢索：flexAnalysis(德國)；BioTools(德國)。

1.3血清蛋白制備吸取400 μl樹脂勻漿于2.0 ml帶濾柱離心管中，10 000 r/min離心10 min，去掉保存液。加入400 μl平衡液，10 000 r/min離心10 min，洗滌樹脂，重復操作一次。緩慢滴加80 μl血清樣本于樹脂上，吸附10 min，10 000 r/min離心10 min，將收集到的樣本再次滴加至樹脂，再吸附10 min，10 000 r/min離心10 min，再加入100 μl平衡液洗滌樹脂，10 000 r/min離心10 min，合并濾液后加入4倍體積丙酮，-20℃沉淀過夜。將沉淀得到的蛋白4℃，12 000 r/min離心20 min，去掉上清，晾干，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诟稍锖蟮牡鞍踪|(zhì)團塊中加入200 μl水化液(RB)，用槍頭將蛋白質(zhì)團塊戳小后反復吹打直至蛋白質(zhì)充分分散。超聲助溶，80 W，0.8 s開，0.8 s關(guān)，超聲4下后放于冰上冷卻，再重復1次，超聲后4℃，12 000 r/min離心20 min，吸出上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。取5、10、15、20、25、30、35 μg的胎牛血清(BSA)制作標準曲線，樣品一般取2～3 μl，雙復管測定。每支管加入1 ml Bradford進行染色，渦旋振蕩20 s，使其充分混勻后即可測定吸光值，測定時兩個樣品之間的操作間隔也應該是20 s左右。打入液體時要均勻，避免產(chǎn)生氣泡。定量分兩次進行，第一次為初步定量，計算得到各樣品的濃度后，將所有樣品濃度盡量調(diào)至比較接近，再進行第二次定量，為了保證定量的準確性，每次定量都需制作標準曲線。

1.4固相pH梯度雙向凝膠電泳根據(jù)定量所得的數(shù)據(jù)吸取相應量的蛋白質(zhì)，分析膠(銀染)的上樣量為銀染120 μg，質(zhì)譜膠(考染)的上樣量為1 200 μg。上樣液的成分為：相應量的蛋白質(zhì)、1%二硫蘇糖醇(DTT)、1%固體梯度膠條緩沖液(IPG Buffer)、1×溴酚藍(BPB)、RB至460 μl。取出水化盤，調(diào)節(jié)水平備用。從冰箱取出干膠條室溫下復溫10 min。吸取離心后的樣品上清液加到水化盤的槽中，將樣本溶液均勻地加入槽底，加樣長約22 cm。取出膠條，使支持膜朝操作者，從酸性端(有字端)開始，輕輕撕下覆蓋膜，膠面朝下，酸性端朝頂端將膠條放入水化盤的槽中，操作過程要避免產(chǎn)生氣泡。放好膠條后再加入1.2 ml覆蓋油于支持膜上保濕，調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度為20℃，讓膠條泡脹過夜(10～12 h)，記錄下膠條的號碼。開機預冷，取出電極板，在等電聚焦盤中加入覆蓋油(每條泳道加入6 ml)。取出膠條并吸干膠條上的覆蓋油(覆蓋油中可能有未被吸進凝膠中的樣液)，膠面朝上將膠條放入等電聚焦盤中。剪好紙墊片，每個墊片加入75 μl Milli Q水進行潤濕，將紙墊片放膠面的兩端，邊緣與膠面邊緣對齊，裝上電極板，選擇膠條數(shù)量后便可開始運行程序。用上槽液配置0.8%的低熔點瓊脂糖40 ml，1.5%的普通瓊脂糖80 ml，燒熔后放于泡沫盒中保溫備用。倒掉玻璃板膠面上的液體，殘留的液體用濾紙片吸干，吸取低熔瓊脂糖封住整個膠面。迅速從平衡管中取出膠條，在裝上槽液的量筒中稍微涮洗一下，將膠條放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把膠條壓到二向膠膠面處，使膠條下端緊密接觸二向膠膠面，注意不要讓膠條下端困住氣泡。依次放好膠條后將玻璃板裝入下槽中，裝玻璃板時可傾斜放入，不讓玻璃板下端困住氣泡。裝好玻璃板后裝上槽，然后在槽與玻璃板的縫隙處加入普通瓊脂糖封住縫隙防止垂直方向上漏電。在上槽中輕輕地加入上槽液至最大刻度處，用上槽液稀釋一倍配置成下槽液后，加入到下槽中直到上下槽液面相平，蓋上蓋子，接上電極后開始電泳。當BPB跑出二向膠以后可停止電泳。二向電泳的程序為：S1 2 W/gel 45 min；S2 17 W/gel直到溴酚藍跑到底，約4.5 h。染色后在掃描前先把掃描儀擦干凈，在玻璃上噴上一些水，再將凝膠轉(zhuǎn)移到掃描儀上，將切了角的一端放在左下角位置，保證每張膠掃描的方向相同，掃描模式為256灰階透視掃描，分辨率為200 dpi。對于考染的質(zhì)譜膠，需在掃描儀的玻璃上墊一張洗干凈的玻璃板，再將膠放在玻璃板上掃描，保證膠面的干凈，以免質(zhì)譜鑒定時引入污染物。掃描完的凝膠用保鮮膜包好后置于4℃保存。圖像分析軟件為ImageMaster 2D platinum 5.0。

1.5質(zhì)譜檢測和分析準備好相應數(shù)量的0.6 ml EP管，做好標記備用。取一塊棉花用75%乙醇潤濕后擦干凈針備用。從4℃冰箱中拿出膠，對著打印圖挖出相應的點，挖點時用針在相應點的邊緣劃一圈，將膠粒挑到EP管中。每挖出一個點就將把針頭在MilliQ水中涮洗一下，接著挖下一個點。挖完點后將膠包好置于4℃保存，將挖出的點放入超凈工作臺中準備處理，并對應點的編號輸入電腦。酶切后取相應數(shù)量的0.2 ml EP管，做好標記備用。取出酶切完的膠粒，在超聲清洗機中超聲處理15 min(超聲處理有助于肽段從膠粒中溶解至覆蓋液里)。吸出覆蓋液至對應的0.2 ml EP管中，每吸一管換一次槍頭，用完的槍頭不要丟掉，放回槍頭盒中的對應位置(下一步仍需用到這些槍頭)。在EP管中加入60 μl抽提液對膠粒進行脫水，震蕩10 min，吸出抽提液至對應的0.2 ml EP管中。真空干燥，直至EP管中液體完全揮發(fā)為止，合上管蓋，-20℃保存。抽干的樣品每管加入1.5 μl的重溶液，震蕩1 min，再吸取管底的重溶液在管壁上涮幾次，將管壁上的肽段充分溶解，再將管底的重溶液反復吹打6～7次。換上新的槍頭，吸取0.8 μl點在鋼靶的小孔內(nèi)，點樣時槍頭不能碰到鋼靶，先懸空將液滴擠出，懸掛在槍頭尖，再輕輕沾到小孔內(nèi)，將鋼靶放在干凈的地方風干。等到小孔內(nèi)液滴完全干燥后，再把剩下的重溶液點到相同的小孔內(nèi)，反復操作，直到所有樣本溶液全部點到小孔上。最后一次點樣后，當液滴揮發(fā)到原體積的1/3左右時，加入0.5 μl基質(zhì)在樣品上，等到完全干燥后即可送入質(zhì)譜儀檢測。利用德國布魯克Ultraflex Ⅲ TOF/TOF質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。UV波長為355 nm，重復速率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 D。掃描質(zhì)量范圍為700～3 200 D，收集信號。胰酶自切峰為內(nèi)標校正質(zhì)譜儀。所有實驗樣品的質(zhì)譜圖均以用默認模式獲得。數(shù)據(jù)庫檢索：利用軟件flexAnalysis過濾基線峰、識別信號峰。利用BioTools軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

2結(jié)果

2.1雙向電泳圖譜及差異斑點分析奈達鉑耐藥和對照的奈達鉑敏感食道癌患者兩組樣本間蛋白質(zhì)點數(shù)無明顯差別，且相互間水平等電聚焦和垂直電泳方向位置偏差無明顯差別，匹配率達86.9%，以示對應兩樣本間蛋白質(zhì)斑點在位置上具有良好重復性和可比性，提示已成功建立食道癌奈達鉑耐藥和敏感的血清蛋白2-DE圖譜，見圖1，圖2。按照差異蛋白質(zhì)點數(shù)的判斷標準，兩組樣本比較后篩選出差異倍數(shù)≥1.5倍的蛋白質(zhì)點為差異斑點。以奈達鉑敏感患者血清樣本作為對照，上調(diào)的斑點有42個，編號為A，下調(diào)的斑點有26個，編號為B。差異蛋白質(zhì)斑點的出現(xiàn)可能與食道癌患者的奈達鉑耐藥特性相關(guān)。

2.2斑點篩選及質(zhì)譜分析結(jié)果從68個差異斑點中篩選出8個分辨清楚的斑點進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定。對質(zhì)譜分析所得肽片與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論肽片進行比對，從而判別所測蛋白。本研究初步鑒定出8個差異蛋白質(zhì)，即谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)P1、乳酸脫氫酶(LDH)-B、Sox-2、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-1和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7表達明顯增高，而E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、激活素結(jié)合蛋白(FS)和磷酸甘油酸激酶(PGK)1表達缺失時，可能有利于食道癌患者形成奈達鉑耐藥性。

圖1　奈達鉑耐藥食道癌患者血清樣本的血清原始雙向電泳圖譜

圖2　奈達鉑敏感食道癌患者血清樣本的血清原始雙向電泳圖譜

3討論

奈達鉑作為治療食道癌的一線用藥，廣泛用于術(shù)前或術(shù)后食道癌病人，具有良好的臨床療效，但是其奈達鉑耐藥是一種普遍發(fā)生的獲得性耐藥〔1〕。不同臨床個體間在耐藥上的差異常?？审w現(xiàn)在患者機體中總蛋白譜表達的差異上，而血清總蛋白由于其有較易的獲取途徑，具有明顯臨床檢測優(yōu)勢，同時蛋白質(zhì)組學方法為研究耐藥機制與血清蛋白間的潛在關(guān)系提供了良好的技術(shù)平臺。在本研究鑒定出的8個蛋白質(zhì)中，GSTP1是研究較多的一種耐藥相關(guān)的關(guān)鍵性蛋白，它是腫瘤細胞及其組織中最常見的同工酶之一，其過度表達有助于增強烷化劑等親電性化療藥物的代謝，使機體產(chǎn)生耐藥性〔3〕。再者，LDH-B〔4〕和PGK1〔5〕在以往的腫瘤耐藥相關(guān)文獻中已有報道。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)細胞黏附分子E-cadherin〔6〕、癌細胞分泌蛋白IGFBP-1〔7〕和外分泌酶MMP-7〔8〕有不同程度的表達增加，這提示了由上皮細胞鈣黏蛋白介導的細胞黏附作用機制在食道癌奈達鉑耐藥方面可能具有顯著作用，而與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的如癌細胞分泌蛋白IGFBP-1、細胞外基質(zhì)分泌酶類MMP-7等也可能會影響奈達鉑療效。激活素結(jié)合蛋白(FS)主要與激活素結(jié)合，抑制其生物活性，在激活素結(jié)合蛋白低表達的患者中，機體可能通過解放更多的激活素對細胞增殖起正向作用，進而可能促進了食道癌奈達鉑耐藥的產(chǎn)生〔9〕。

本研究發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的Sox2基因是一種干細胞標志基因，其表達調(diào)控具高敏感性，也被用于與干細胞其他表面標志一起鑒定干細胞亞群，已有研究證實Sox2異常表達與結(jié)直腸癌和乳腺癌等密切相關(guān)，提示了腫瘤干性與食道癌奈達鉑耐藥的潛在關(guān)系，但尚待進一步研究證明。

4參考文獻

1Toshimitsu H，Hashimoto K，Tangoku A，etal.Molecular signature linked to acquired resistance to cisplatin in esophageal cancer cells〔J〕.Cancer Lett，2004；211(1)：69-78.

2傅劍華，王耿，楊弘，等.食管癌術(shù)前放化療后臨床再分期的評價〔J〕.中華胃腸外科雜志，2009；12(1)：12-6.

3Arai T，Miyoshi Y，Kim SJ，etal.Association of GSTP1 expression with resistance to docetaxel and paclitaxel in human breast cancers〔J〕.Eur J Surg Oncol，2008；34(7)：734-8.

4Zhang JT，Liu Y.Use of comparative proteomics to identify potential resistance mechanisms in cancer treatment〔J〕.Cancer Treat Rev，2007；33(8)：741-56.

5Chuthapisith S，Layfield R，Kerr ID，etal.Proteomic profiling of MCF-7 breast cancer cells with chemoresistance to different types of anti-cancer drugs〔J〕.Int J Oncol，2007；30(6)：1545-51.

6Zhang P，Liu H，Xia F，etal.Epithelial-mesenchymal transition is necessary for acquired resistance to cisplatin and increases the metastatic potential of nasopharyngeal carcinoma cells〔J〕.Int J Mol Med，2014；33(1)：151-9.

7Lee C，Safdie FM，Raffaghello L，etal.Reduced levels of IGF-I mediate differential protection of normal and cancer cells in response to fasting and improve chemotherapeutic index〔J〕.Cancer Res，2010；70(4)：1564-72.

8Ansell A，Jerhammar F，Ceder R，etal.Matrix metalloproteinase-7 and-13 expression associate to cisplatin resistance in head and neck cancer cell lines〔J〕.Oral Oncol，2009；45(10)：866-71.

9Rahman M，Chan AP，Tang M，etal.A peptide of SPARC interferes with the interaction between caspase8 and Bcl2 to resensitize chemoresistant tumors and enhance their regression in vivo〔J〕.PLoS One，2011；6(11)：e26390.

〔2015-07-10修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1825-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.015

1中山大學附屬第一醫(yī)院手術(shù)室

第一作者：馬俊(1978-)，男，主治醫(yī)師，博士，主要從事普胸外科的研究。