金鳳媚,薛　俊,宋　建,于海濤,段紅英

(1.天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,天津　300192;2.天津市西青區(qū)植物保護(hù)站,天津　300380)

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天津地區(qū)番茄褪綠病毒的分子檢測與基因組部分序列分析

金鳳媚1,薛俊1,宋建1,于海濤1,段紅英2

(1.天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,天津300192;2.天津市西青區(qū)植物保護(hù)站,天津300380)

摘要：為了確定天津番茄產(chǎn)區(qū)是否發(fā)生了番茄褪綠病毒病,了解該病毒天津分離物的主要基因是否發(fā)生變異,對該地區(qū)發(fā)生的ToCV 進(jìn)行了分子檢測,并對該病毒的外殼蛋白(CP)和熱激蛋白70類似物(Hsp70h)的核苷酸和氨基酸進(jìn)行了序列分析。結(jié)果表明,天津分離物CP蛋白的核苷酸和氨基酸序列與已報(bào)道的具有代表性的不同國家的分離物相似性均在97.3%以上。Hsp70h蛋白的核酸和氨基酸序列與已報(bào)道的具有代表性的不同國家的分離物相似性均在97.2%以上。表明CP和Hsp70h蛋白是2個最保守的蛋白。這是首次在分子水平上證明番茄褪綠病毒在天津地區(qū)為害。

關(guān)鍵詞：番茄褪綠病毒;分子檢測;外殼蛋白;熱激蛋白70類似物;基因序列分析

番茄(LycopersiconesculentumMill.)是我國設(shè)施栽培的主要蔬菜作物之一,在蔬菜周年供應(yīng)上占有重要地位。番茄病毒病一直是影響番茄產(chǎn)量的重要病害。番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)自20世紀(jì)90年代在美國發(fā)現(xiàn)以來,已在世界多地相繼發(fā)生,并造成了嚴(yán)重的損失[1-5]。番茄褪綠病毒(ToCV)屬于長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus),為正單鏈RNA病毒。2013年以來在我國的北京、山東、河南、河北及南京等地的番茄生產(chǎn)區(qū)陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)了番茄褪綠病毒[6-12]。感染該病毒的番茄植株,下部葉片首先發(fā)病,發(fā)病初期葉片脈間變黃,葉脈顏色加深,葉片增厚,植株死亡,極大降低了番茄品質(zhì)與產(chǎn)量[13]。

番茄是天津地區(qū)的主要蔬菜作物,在蔬菜產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。自2014年11月以來,天津部分番茄產(chǎn)區(qū)如西青第六阜和工農(nóng)聯(lián)盟一帶及寶坻的方家莊等地,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了疑似番茄褪綠病毒的植株。由于其癥狀非常類似營養(yǎng)缺失的褪綠黃化,很多農(nóng)戶作為缺素癥來進(jìn)行防治,噴施了大量營養(yǎng)肥亦未見好轉(zhuǎn)，嚴(yán)重影響了坐果和產(chǎn)量,給當(dāng)?shù)氐姆焉a(chǎn)造成了巨大的損失。因此,開展天津地區(qū)番茄褪綠病毒病檢測鑒定對于明確番茄褪綠病毒的病源及進(jìn)行綜合防治具有重要意義。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)對天津番茄主產(chǎn)區(qū)的病株樣本進(jìn)行了病原分子鑒定,并對獲得分離物的2個保守蛋白—外殼蛋白(Coat protein,CP)和熱激蛋白(Heat shock protein 70,Hsp70)的變異情況進(jìn)行了初步分析,以期為番茄褪綠病毒病的診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病樣來源2014年11-12月在天津市西青區(qū)第六阜日光溫室番茄栽培田中,采集葉脈間變黃、葉脈顏色加深等典型癥狀的葉片樣本,保存于-80 ℃冰箱,用于核酸提取的后續(xù)試驗(yàn)。以健康的番茄植株葉片作為對照。

1.1.2 菌株和試劑大腸桿菌DH5α、T-easy、RNA提取試劑、RNase Inhibitor、M-MLV均購自寶生物(大連)工程有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1番茄葉片總RNA的提取及第一鏈擴(kuò)增取發(fā)病的番茄葉片0.1 g,加液氮研磨成粉,按RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA的提取。反轉(zhuǎn)錄體系:模板RNA 1 μL,Random 引物1 μL,dNTP 0.5 μL,用DEPC處理水補(bǔ)足10 μL。70 ℃變性10 min,置于冰上2 min后,加入下列試劑:5×M-MLV Buffer 5 μL,RTaseM-MLV 1 μL,RNAase Inhibitor 0.5 μL,總體積10 μL。37 ℃保溫1 h。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Dovas等[14]設(shè)計(jì)的1對檢測ToCV的引物,用于擴(kuò)增該保守區(qū)的450 bp的片段,引物名稱為ToC5 /ToC6(表1)。為了增加檢測的可信度,同時利用擴(kuò)增ToCV的CP部分基因的引物進(jìn)行檢測,引物名稱為CP-F/CP-R[15]。根據(jù)GenBank登錄的序列信息,利用Primer 3設(shè)計(jì)引物HSPF/R和HSP2F/R,用于擴(kuò)增ToCV的Hsp70h。引物序列由寶生物(大連)工程技術(shù)有限公司(TaKaRa)合成。

表1　本研究中用到的PCR引物

1.2.3PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物克隆PCR總體積為25 μL,其中包括10×反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)2.5 μL,dNTP混合物(2.5 mmol/L)0.5 μL,上游引物(10 μmol/L) 2.5 μL,下游引物(10 μmol/L)2.5 μL,模板 DNA 0.5～2.0 μL,DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,其余用水補(bǔ)足。反應(yīng)程序:94 ℃變性2 min;94 ℃30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃1.5 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物分離純化后,克隆到T-easy載體(按試劑盒說明操作)。自動測序由TaKaRa公司完成,測序時選取2個陽性克隆,雙向測序。

1.2.4序列分析利用Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行序列比較,DNAMAN Version 5.22 (Lynnon Biosoft,Quebe Canada)和MEGA 6.0進(jìn)行序列比較和進(jìn)化樹的構(gòu)建及同源性分析。

2結(jié)果與分析

2.1分子鑒定結(jié)果

對西青區(qū)2個產(chǎn)地采集的20個具有典型癥狀的病株樣品,進(jìn)行RNA提取和RT-PCR檢測。利用引物ToC5/ToC6,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得1條預(yù)期大小約450 bp的特異片段(圖1)。利用CP-F/CP-R擴(kuò)增出了840 bp大小的條帶(圖2)。利用DNAMAN對序列進(jìn)行分析,獲得了ToCV的外殼蛋白的全長序列。目前已將該序列登錄到 GenBank中,序列號為KP246844。初步證明該病是由番茄褪綠病毒ToCV引起。

圖1　ToC5/ToC6引物PCR擴(kuò)增

2.2番茄褪綠病毒的CP基因和蛋白序列比較

利用GenBank中的Blast程序?qū)μ旖虻貐^(qū)發(fā)生的ToCV基因組部分序列進(jìn)行相似性檢索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。由于與其相似的序列眾多,選擇了一些具有代表性的分離物序列來進(jìn)行同源性的比較。這些序列為國內(nèi)目前已報(bào)道的發(fā)生番茄褪綠病毒的分離物以及世界不同地區(qū)有代表性的分離物(表2)。

圖2　CP-F/CP-R引物PCR擴(kuò)增

序號No.毒株 Isolates 年份Year國家Country登錄號 Accession 1SDSG2013中國山東KC7095102BJ2013中國北京KC8879993HP2015韓國KP1145374Florida2006美國AY9034485Saopaulo2012巴西JQ9526016Gr-5352008西臘EU2847447Bouches-du-Rhone2009法國EU6253508AT80/99-IC2014西班牙KJ7402579Tochigi2010日本AB513442(HSP)AB513443(CP)

利用生物信息學(xué)軟件Mega 5.0對ToCV病毒CP蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖3,4)。結(jié)果表明,大部分國家和地區(qū)分離物的核苷酸形成一個大分支，只有法國分離物形成單獨(dú)分支。蛋白的分析表明法國和西班牙在一個分支上，其他分離物在一個大分支上。說明不同地區(qū)和國家的分離物進(jìn)化關(guān)系很近。只有法國和西班牙與其他地區(qū)在蛋白水平上的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

利用DNAMAN進(jìn)行相似性分析,表明ToCV天津分離物的CP蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列與表1中所列的亞洲國家和地區(qū),如韓國、日本、山東、北京、巴西、希臘、美國的分離物同源性均在99.0%以上,與西班牙、法國的分離物相似性為97.3%以上(圖4)。證明ToCV在全世界范圍內(nèi)的變異頻率不是很高,保守性很強(qiáng),這也符合CP蛋白的特點(diǎn),而且該病毒的基因變異大部分屬于無義突變。

圖3　CP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3番茄褪綠病毒的Hsp70h基因的克隆和核苷酸及蛋白序列比較

2.3.1番茄褪綠病毒的Hsp70h基因的克隆對所采集的病株樣品進(jìn)行Hsp70h基因的RT-PCR檢測。通過NCBI查找到相關(guān)的ToCV序列,利用HSPF/R引物擴(kuò)增出了1 021 bp大小的條帶(圖5),利用HSP2F/R基因擴(kuò)增出了911 bp的條帶(圖6)將2條片段進(jìn)行回收克隆并測序,然后將測序結(jié)果進(jìn)行拼接,得到了ToCV熱激蛋白天津分離物(HSP-TJ)的全序列(登錄號為KP893120)。

圖4　CP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5　HSPF/R引物PCR擴(kuò)增

圖6　HSP2F/R引物PCR擴(kuò)增

2.3.2番茄褪綠病毒的Hsp70h基因核苷酸及蛋白序列比較系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,除法國分離物以外,其余的各地區(qū)的分離物形成一個大分支,其中山東和北京的分離物關(guān)系最近,日本和韓國分離物關(guān)系最近,巴西和希臘關(guān)系較近,而天津的分離物與西班牙分離物關(guān)系較近(圖7,8)。

圖7　Hsp70h基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

在核苷酸水平上,天津分離物與中國其他地區(qū)的分離物以及亞洲(韓國、日本)、美國、巴西、希臘、西班牙的相似性均為99.3%以上,與法國的相似性為98.5%。在氨基酸水平上,天津分離物與山東、北京、亞洲、巴西和西班牙的分離物相似性為98.0%以上;與法國分離物的相似性為97.2%。從同源性分析可以看出，雖然各地區(qū)分離物形成了不同的分支，但相似性均在97.2%以上，變異性不大，這也證明了Hsp70h是該科病毒最保守的蛋白之一[16]。在分離物之間的比較可以看出,地理距離較近的亞洲各分離物之間同源性均達(dá)到了100.0%。天津和法國的分離物核苷酸的同源性為98%，而氨基酸的同源性為97.2%,說明在Hsp70h基因的核苷酸發(fā)生了插入或缺失突變,從而導(dǎo)致了氨基酸的變異。

圖8　Hsp70h蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,在天津地區(qū)發(fā)生的番茄褪綠病確為番茄褪綠病毒(ToCV)引起,這是首次在分子水平驗(yàn)證該病毒在天津地區(qū)的發(fā)生。番茄植株感病后主要表現(xiàn)為葉片脈間黃化,類似缺素癥。葉質(zhì)變脆易碎[17]。以植株下部葉片明顯,上部新葉不明顯，植株感病后坐果少。我們對該病毒在分子進(jìn)化中較保守的外殼蛋白CP和熱激蛋白Hsp70h[16,18]進(jìn)行的克隆和序列分析表明,ToCV天津分離物的外殼蛋白核苷酸及序列和氨基酸序列與空間距離較近的山東、北京、韓國、日本、美國的同源性為99.0%以上，與空間距離較遠(yuǎn)的西班牙、法國等國家的同源性為97.3%以上。這在一定程度上說明此病毒的地域性很強(qiáng)。同時它又與空間距離較遠(yuǎn)的美國分離物的同源性也在99.0%以上，這可能是人類的貿(mào)易活動攜帶了染有病毒的番茄種子或介體，從而使兩地的病毒基因序列相似性高。通過對Hsp70h蛋白的分析也能看出病毒傳播的地域性很強(qiáng),如地理距離較近的亞洲各分離物之間相似性均達(dá)到了100.0%。

近年來,在天津地區(qū)的番茄上發(fā)生的主要病毒病為番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)[19],番茄褪綠病毒的傳播介體與番茄黃化曲葉病毒一樣可由煙粉虱傳播,且在各型煙粉虱上均能有效傳播[20]。所以在生產(chǎn)上,經(jīng)常能發(fā)現(xiàn)此2種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。對該病的防治,在沒有抗病品種問世之前,主要還是預(yù)防傳播介體煙粉虱的發(fā)生。雖然目前在天津的其他番茄產(chǎn)區(qū)還未見具有明顯癥狀的病株,但隨著番茄種苗在不同地區(qū)的調(diào)運(yùn),也會加速該病毒的廣泛傳播,所以相關(guān)部門要加強(qiáng)對該病的檢測及傳播介體的防治,以最大限度地預(yù)防該病毒的傳播。

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Molecular Detection and Partial Genome Sequence Analysis ofTomatochlorosisvirusin Tianjin

JIN Fengmei1,XUE Jun1,SONG Jian1,YU Haitao1,DUAN Hongying2

(1.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin300192,China;2.Tianjin Xiqing District Plant Protection Station,Tianjin300380,China)

Abstract：The purpose of this study was to determine whether the tomato plants in Tianjin was infected by Tomato chlorotic virus (ToCV) and whether variation had occurred in the important genes of ToCV.ToCV isolated in Tianjin was diagnosis at molecular level.The genome sequence of coat protein and heat shock protein had been cloned and analyzed.The results showed that the homology of the CP isolate in Tianjin was 97.3% or more with the representative isolates of different countries and regions.The homology of the Hsp70h isolate in Tianjin was 97.2% or more with the representative isolates of different countries and regions.It is proved that Hsp70h and CP protein are the most conserved proteins.This is the first report of Tomato chlorosis virus occurrence in Tianjin.

Key words:Tomato chlorosis virus;Molecular detection;CP;Hsp70h;Genome sequence analysis

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.005

中圖分類號：S436.412

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0023-05

作者簡介：金鳳媚(1977-)，女，天津人，副研究員，碩士，主要從事番茄分子育種研究。

基金項(xiàng)目：天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目(201302040)；國家星火計(jì)劃(2015GA610002)

收稿日期：2015-12-10