孫曉輝,王樹森,高利利,喬　寧,劉永光,趙　靜,竺曉平

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院,山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點實驗室,山東 泰安　271018;2.山東省諸城市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合辦公室,山東 諸城　262200;3.濰坊科技學(xué)院 蔬菜花卉研究所,山東 壽光　262700 )

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山東葫蘆科蔬菜上病毒病種類檢測及黃瓜花葉病毒分離物的亞組鑒定

孫曉輝1,王樹森2,高利利1,喬寧3,劉永光3,趙靜3,竺曉平1

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院,山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點實驗室,山東 泰安271018;2.山東省諸城市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合辦公室,山東 諸城262200;3.濰坊科技學(xué)院 蔬菜花卉研究所,山東 壽光262700 )

摘要：為了檢測和鑒定山東地區(qū)葫蘆科蔬菜上病毒病種類,從山東諸地11個蔬菜種植區(qū)采集了867個葫蘆科蔬菜疑似感病樣品。利用黃瓜花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、西瓜花葉病毒、煙草花葉病毒、小西葫蘆黃花葉病毒、南瓜花葉病毒、甜瓜黃斑病毒、瓜類褪綠黃化病毒、李屬壞死環(huán)斑病毒及甜瓜壞死斑點病毒等特異性引物對疑似感病樣品分別進行RT-PCR檢測,各病毒檢出率分別為34.8%,10.4%,20.0%,41.7%,27.0%,7.8%,2.6%,1.7%,0,0.9%。表明除PNRSV外,其他9種病毒在山東各地均有發(fā)生,且CMV和TMV發(fā)病率較高,2種或2種以上病毒復(fù)合侵染也很普遍。同時為明確山東地區(qū)CMV分離物的株系分化狀況,選取11個地區(qū)有代表性的CMV陽性樣品,測定其外殼蛋白(Coat protein,CP)和RNA3核苷酸序列并進行序列比對和進化分析,結(jié)果顯示侵染山東地區(qū)葫蘆科蔬菜的CMV分離物均屬于IB亞組,與韓國分離物As(AF013291)相似性最高,未發(fā)現(xiàn)其他株系。

關(guān)鍵詞：瓜類病毒病;黃瓜花葉病毒;RT-PCR;亞組

病毒病的蔓延流行嚴(yán)重制約著黃瓜、西葫蘆和西瓜等葫蘆科蔬菜的生產(chǎn),葫蘆科蔬菜病毒病種類有黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)、西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)、小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)、南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus,SqMV)、番木瓜環(huán)斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV)、南瓜蚜傳黃化病毒(Cucurbitaphid-borneyellowsvirus,CABYV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotilarvirus,PNRSV)、甜瓜壞死斑點病毒(Melonnecroticspotvirus,MNSV)等38個確定種9個暫定種和1種類病毒確定種[1],在我國主要有PRSV[2]、CABYV[3]、SqMV[4]、CMV[5]、WMV[6]、ZYMV[7]、TMV[8]、CGMMV[9]、MNSV[10]等。山東省作為主要的設(shè)施蔬菜產(chǎn)區(qū),葫蘆科蔬菜上病毒病的發(fā)生比較嚴(yán)重,據(jù)有關(guān)學(xué)者的報道[5-12]表明,病毒的種類也較多[5-12],但多年來缺少針對葫蘆科蔬菜病毒病的系統(tǒng)及全面的檢測和鑒定。

本試驗通過分子檢測手段對山東葫蘆科蔬菜上的病毒病病原種類及其主次關(guān)系進行了全面檢測和鑒定,并針對近年來在山東蔬菜產(chǎn)區(qū)發(fā)病較為普遍的CMV,通過序列測定確定了其亞組歸屬,以期為葫蘆科蔬菜上抗病品種的選育及病毒病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1感病樣品采集2014年7-8月,從山東的泰安、淄博、濰坊、臨沂、聊城、菏澤、青島、煙臺、威海、日照、濟寧11個地級市的南瓜、絲瓜、黃瓜、西瓜、西葫蘆產(chǎn)區(qū)共采集到867個葫蘆科蔬菜疑似感病樣品,其中設(shè)施蔬菜567株,種苗300株。將采集到的樣品保存在-80 ℃冰箱,用于后續(xù)試驗。

1.1.2菌株、載體和生化試劑大腸桿菌DH5α菌株由山東省蔬菜病蟲生物學(xué)實驗室留存;Recombinant RNase Inhibitor、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、T4DNA連接酶及克隆載體pMD18-T購自寶生物工程(大連)(TaKaRa Biotechnology,Dalian)有限公司;快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Ⅱ(離心柱型)購自北京百泰克生物技術(shù)(Bio Teke Corporation)有限公司;TRIzol 試劑、TaqDNA聚合酶、dNTPs及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans 2K plus均購自北京全式金生物技術(shù)(Trans Gen Biotech)有限公司;其他常用生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2試驗方法

1.2.1山東葫蘆科蔬菜病毒病種類檢測本試驗用引物序列見表1。RNA提取采用TRIzol法,而后利用CMV、CGMMV、TMV、ZYMV、WMV、CCYV、PNRSV和MYSV等特異性引物對葫蘆科疑似感病樣品分別進行RT-PCR檢測,反應(yīng)程序為:預(yù)變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s,退火(退火溫度)30 s,延伸72 ℃ 1 min,共32個循環(huán)；終延伸72 ℃ 10 min。

取25 μL PCR擴增產(chǎn)物與4 μL 6×Loading Buffer混合于1%的瓊脂糖凝膠上檢測并拍照記錄試驗結(jié)果。從各縣區(qū)陽性樣品中,選擇1～2個切取目的條帶利用凝膠回收試劑盒回收,回收產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用含氨芐青霉素(Amp)的培養(yǎng)基進行篩選。陽性克隆經(jīng)菌液PCR驗證后委托上海鉑尚生物科技有限公司進行測序。

1.2.2CMV序列分析及株系鑒定從山東11個地區(qū)感病樣品中分別選取具有代表性的分離物的CMV CP和RNA3 陽性克隆送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。所得序列在NCBI上利用Blast 進行檢索,利用DNAStar軟件中的MegAlign將所得序列與GenBank中已登錄的亞組IA、亞組IB和亞組II的代表序列進行同源性比對。利用軟件Mega 5.05的Clustal W法進行多序列比對分析以及鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,系統(tǒng)進化樹中各分支置信度(Bootstrap)進行1 000次重復(fù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1病毒檢出率和復(fù)合病毒檢出率

在山東采集的567個設(shè)施樣本中檢測到CMV、CGMMV、TMV、ZYMV、WMV、SqMV、CCYV、MYSV和MNSV 9種病毒的存在,所有檢測到的病毒均經(jīng)測序驗證為該種病毒,沒有檢測到PNRSV病毒的存在,各病毒的樣本檢出率見圖1,其中從圖1中可以看出TMV和CMV的病毒檢出率最高,ZYMV和WMV其次,CCYV、MYSV和MNSV的病毒檢出率相對較低,300株種苗帶毒率為14.7%。另外,在采集到的設(shè)施樣本中發(fā)現(xiàn)病毒的綜合復(fù)合侵染率為37.4%,2種病毒的復(fù)合侵染率為18.2%,3種病毒的復(fù)合侵染率為11.3%,4種病毒的復(fù)合侵染率為3.5%,5種病毒的復(fù)合侵染率為4.4%,未測到更多種病毒的復(fù)合侵染。

表1　用于病毒檢測的引物序列

圖1　單一病毒檢出率和復(fù)合病毒檢出率

2.2CMV PCR擴增結(jié)果及亞組鑒定

2.2.1以待測葫蘆科樣品提取的RNA為模板,利用特異性引物CMV-CPF/R和CMV3F/R進行RT-PCR擴增,取5 μL擴增產(chǎn)物利用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測分析。結(jié)果如圖2,分別出現(xiàn)777 bp左右的條帶(分別包含CP全基因組片段及其上下游側(cè)翼序列)和2.3 kb左右的條帶(分別包含RNA3全基因組片段及其上下游側(cè)翼序列)。

A.特異性引物CMV-CPF/CMV-CPR擴增結(jié)果：1～11.葫蘆科樣品；M.Trans 2K Plus DNA Marker；CK.陰性對照；

分離物Isolatesname地點Loca.tion登錄號AccessionNo.寄主植物Hostplant片段Protein分離物Isolatesname地點Loca.tion登錄號AccessionNo.寄主植物Hostplant片段ProteinSD-HZ菏澤KP710840西瓜CPBY16湖北KF564789芋頭CPSD-JN濟寧KP710854南瓜CPCah1浙江FJ268746美人蕉CPSD-LC聊城KP710841絲瓜CPCMV-Cu伊朗EF620777黃瓜CPSD-LY臨沂KP710842絲瓜CPHB24鄭州KC019301不確定CPSD-QD青島KP710843南瓜CPSFQT1-2新疆HQ283393番茄CP、RNA3SD-RZ日照KP710844南瓜CPNt9臺灣D28780不確定CP、RNA3SD-TA泰安KP710845西葫蘆CPO日本D00385不確定CP、RNA3SD-WH威海KP710847南瓜CPXb福建AF268598香蕉CP、RNA3SD-WF濰坊KP710846南瓜CPLS美國AF127976不確定CP、RNA3SD-YT煙臺KP710848南瓜CPLY澳大利AF198103不確定CP、RNA3SD-ZB淄博KP710849南瓜CPAs韓國AF013291不確定CP、RNA3QDR青島KP710852南瓜RNA3ER美國U15730豇豆CP、RNA3WHR威海KP710851南瓜RNA3Ns匈牙利AJ511990葉煙CP、RNA3TAR泰安KP710853南瓜RNA3Legume日本D16405豇豆CP、RNA3ZBR淄博KP710850南瓜RNA3Fny美國D10538不確定RNA3Barcelona西班牙AM183116番茄CPtrk7匈牙利L15336不確定RNA3S美國AF063610不確定CPTfn意大利Y16926番茄RNA3SDTA泰安FJ403473辣椒CPp1-1西班牙AM183116番茄RNA3Lucknow印度EF153734番茄CPPhy浙江DQ412732不確定RNA3AMA荷蘭AJ131625觀賞作物CPI17F法國Y18137不確定RNA3

2.2.2CMV山東分離物序列分析利用MegAlign方法,對選取的CP和RNA3核苷酸序列進行相似性比較分析(表2)。

CP核苷酸序列比對結(jié)果顯示,本研究獲得的11個樣品的CP核苷酸序列相似性為97.2%～99.9%;與CMV亞組Ⅱ株系分離物相似性較低,為77.0%～78.5%;與CMV亞組IA株系分離物的相似性較高,為92.4%～94.5%;與CMV亞組IB株系分離物的相似性最高,為93.3%～97.6%,其中與CMV亞組IB株系韓國(Korea)分離物As(AF013291)的相似性最高。RNA3核苷酸序列比對結(jié)果顯示:獲得的4個RNA3全序列相似性為94.4%～99.3%;與CMV亞組Ⅱ株系分離物相似性較低,為67.4%～69.8%,與CMV亞組IA株系分離物的相似性為86%～91.2%,與CMV亞組IB分離物的相似性最高,為89%～93.8%,其中與CMV亞組IB的韓國(Korea)分離物As(AF013291)的相似性最高。

為了更好地分析其進化歷程和親緣關(guān)系,選取世界各地有代表性的CMV分離物的CP和RNA3核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)。從構(gòu)建的2個系統(tǒng)進化樹可以看出,山東CMV各分離物的CP和RNA3核苷酸序列與韓國(Korea)分離物As(AF013291)親緣關(guān)系最近,與同源性比對結(jié)果相一致,同屬于CMV IB亞組。

A.基于CP基因的系統(tǒng)進化樹;B.基于RNA3的系統(tǒng)進化樹。

3結(jié)論與討論

山東是蔬菜生產(chǎn)主要地區(qū),病毒病較為嚴(yán)重種類也較多。目前,山東雖然有CMV[5]、WMV[6]、ZYMV[7]、TMV[8]、CGMMV[9]、MNSV[10]的相關(guān)報道,但缺少全面而系統(tǒng)的檢測,病毒種類、主次關(guān)系及復(fù)合侵染情況不明確,缺少重要病毒的株系分化鑒定。

本試驗利用多對針對不同瓜類病毒的特異性引物對山東11個地區(qū)采集到的葫蘆科蔬菜樣品進行RT-PCR檢測,檢測到的病毒種類及發(fā)病嚴(yán)重程度由大到小排序如下:TMV、CMV、ZYMV、WMV、CGMMV、SqMV、MYSV、CCYV、MNSV,并且復(fù)合侵染情況較重,檢出的病毒復(fù)合組合中除了CMV與MYSV、WMV與SqMV和CCYV、ZYMV與CCYV、SqMV與MYSV、CCYV與MYSV和MNSV與所測病毒均未發(fā)現(xiàn)復(fù)合侵染外,其他的組合均存在復(fù)合侵染的情況,并且這些組合中CMV和TMV的復(fù)合侵染率最高。這可能與山東地區(qū)葫蘆科作物的大面積種植、栽培模式的多樣化以及廣泛的傳毒媒介有關(guān)。CMV是迄今已知病毒中寄主范圍最廣泛、分布最廣、危害最嚴(yán)重也是目前研究最多最具經(jīng)濟重要性的一種植物病毒[13]。在我國,葫蘆科蔬菜上的CMV在南京[17]、廣州[18]、浙江[19]、新疆[20]等多地均有發(fā)現(xiàn)。

黃瓜花葉病毒是一種RNA病毒具有很強變異性和適應(yīng)性,在世界各地分布廣泛,能夠侵染1 000多種植物,因而其株系分化十分復(fù)雜[18,21-22]。不同地區(qū)和不同寄主植物上CMV分離物的生物學(xué)性狀和分子生物學(xué)特性存在明顯差異[23],導(dǎo)致育種難度加大。CMV分為不同的株系,Pita等[24]根據(jù)寄主范圍、癥狀反應(yīng)、血清學(xué)以及CP序列差異將CMV分為亞組Ⅰ和亞組Ⅱ,不同亞組株系在致病性、寄主范圍等方面有一定差異,如亞組Ⅰ常引起壞死、蕨葉等較為嚴(yán)重的癥狀。Palukaitis等[25-26]基于基因組RNA3的5′端的非編碼區(qū)序列將亞組Ⅰ進一步分為亞組ⅠA和亞組ⅠB。序列分析是劃分CMV株系的最主要的技術(shù)與方法,應(yīng)用也越來越廣泛[13,27]。它從分子水平揭示了CMV分離物不同亞組之間的差異。我國CMV分離物也存在著株系分化,我國絕大多數(shù)地區(qū)CMV分離物都隸屬于CMV亞組Ⅰ[28-33],徐平東等[13]首次測定了我國分離物亞組Ⅱ的CP基因序列,從分子水平證實了在我國存在CMV的2個亞組。

本研究在山東的西瓜、南瓜、絲瓜、西葫蘆等葫蘆科作物上獲得的11個樣品的CP、RNA3經(jīng)分子比對和進化分析發(fā)現(xiàn)這些樣品均歸屬于CMV亞組ⅠB。與除了福建以外的我國其他序列均處于一個大分支上,且序列與葫蘆科寄主無明顯的相關(guān)性。由于山東葫蘆科蔬菜上CMV亞組的單一性,可以針對這一亞組培育抗病品種來控制病毒病的發(fā)生,為葫蘆科蔬菜的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

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Detection of Viruses Infecting Cucurbit Vegetables in Shandong and Identification of Subgroup of theCucumbermosaicvirusIsolates

SUN Xiaohui1,WANG Shusen2,GAO Lili1,QIAO Ning3,LIU Yongguang3,ZHAO Jing3,ZHU Xiaoping1

(1.College of Plant Protection,Shandong Agricultural University,Shandong Provincial Key Laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests,Taian271018,China;2.Zhucheng Intergrated Office of Agriculture and Countryside,Zhucheng262200,China;3.Institute of Vegetables and Flowers,Weifang University of Science and Technology,Shouguang262700,China)

Abstract：In order to detect and identify the viral causing agent that infecting cucurbit vegetable plants in Shandong,867 cucurbit plant samples of suspected viral diseases from 11 vegetable planting areas in Shandong were collected during July to August,2014.9 primer pairs specific to Cucumber mosaic virus(CMV),Cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV),Watermelon mosaic virus(WMV),Tobacco mosaic virus(TMV),Zucchini yellow mosaic virus(ZYMV), Squash mosaic virus(SqMV),Melon yellow spot virus(MYSV),Cucurbit chlorotic yellows virus(CCYV),Prunus necrotic ringspot ilarvirus(PNRSV)and Melon necrotic spot virus(MNSV)were used respectively to perform PCR detection.The results showed that viruses carried rate was 34.8%,10.4%,20.0%,41.7%,27.0%,7.8%,2.6%,1.7%,0 and 0.9% respectively.The natural infection of these viral diseases except PNRSV in Shandong was confirmed,and the incidence of CMV and TMV were higher than others.Two or more than two viruses mixed infections were also very common in field.At the same time,those CMV positive samples from 11 regions were selected for subgroup classification.Coat protein(CP)gene and the whole RNA3 nucleotide sequences were determined.Sequence alignment and phylogenetic analyses were performed.The results showed that the CMV isolates of cucurbit vegetables in Shandong area were all members of CMV subgroup IB with the highest similarity to a South Korea isolate As(AF013291),no other strains were found.

Key words:Cucurbit viral disease;Cucumber mosaic virus;RT-PCR;Subgroup

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.034

中圖分類號：S432.4+1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0211-07

作者簡介：孫曉輝(1989-),男,山東威海人,在讀碩士,主要從事植物病理學(xué)研究。通訊作者：竺曉平(1966-),男,江蘇六合人,教授,博士,主要從事植物病理學(xué)研究。

基金項目：國家公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)科研專項資助項目(201303028);山東省科技發(fā)展計劃資助項目(2014GNC111008);山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2015CQ022)

收稿日期：2016-02-19